《Soil and Tillage Research》：Combination of cover crops and microbial biostimulants: Impacts on soil functioning, grape production, and juice quality in rainfed vineyards
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本研究评估了两种可持续农业管理策略——覆盖作物（cover crops）与微生物生物刺激素（microbial biostimulant）——对雨养葡萄园土壤功能、葡萄产量及果汁品质的联合影响。研究假设：（i）覆盖作物的存在将正向影响土壤功能，包括增强胞外酶活
本研究评估了两种可持续农业管理策略——覆盖作物（cover crops）与微生物生物刺激素（microbial biostimulant）——对雨养葡萄园土壤功能、葡萄产量及果汁品质的联合影响。研究假设：（i）覆盖作物的存在将正向影响土壤功能，包括增强胞外酶活性（extracellular enzyme activity）、分解速率及有机质的生化稳定化；（ii）固氮生物刺激素的使用会降低与氮循环相关的微生物活性，并增强针对磷（P）或硫（S）等其他必需营养元素的微生物活动；（iii）覆盖作物与微生物生物刺激素协同施用时，其有益效应最为显著；（iv）微生物生物刺激素将提升葡萄园生产力并改善作物品质。为此，研究人员在西班牙南部赫雷斯地区（Sherry Region）的一个西拉（Syrah）葡萄园内开展了一项全因子实验，设置两个覆盖作物水平（全年翻耕 vs. 冬春覆盖作物）与三个微生物生物刺激素水平（无生物刺激素、1倍推荐剂量、3倍推荐剂量），共六种处理组合，每种处理设八个重复（即48株目标植株）。研究测定了土壤微生物胞外酶活性（涉及碳[C]、氮[N]、磷[P]、硫[S]循环）、凋落物分解速率及稳定化因子、葡萄产量及果汁可溶性固形物含量（oBrix）与pH值。结果表明，覆盖作物显著提升了与C、N、P循环相关的土壤胞外酶活性，而生物刺激素对土壤酶活性的影响在不同季节间不一致。覆盖作物与生物刺激素的组合处理维持或提升了葡萄产量。果汁的oBrix与pH值显示出覆盖作物与生物刺激素之间的交互作用。结构方程模型（structural equation modeling, SEM）揭示了二者通过土壤介导与植物介导的互补路径实现改良效果。综上，覆盖作物与微生物生物刺激素的协同应用是实现葡萄园可持续管理的一种有效策略。
一、研究背景与科学问题
全球葡萄栽培面积达720万公顷，是一项具有重要经济、社会和环境意义的古老农业实践。然而，当前集约化的葡萄园管理方式，如频繁耕作和过度使用植保产品，导致土壤退化加剧，表现为土壤理化性质和生物学特性恶化，进而引起葡萄产量下降和最终葡萄酒品质降低（如复杂香气丧失）。同时，农药的过量使用还会在终产品中累积，改变葡萄酒的感官特性，甚至迫使酿酒过程中添加更多添加剂。此外，社会对更具可持续性、具有本土特色的产品的关注日益增长。因此，亟需研究和推广既能提升葡萄园品质和生产力，又不损害环境的管理技术。
在此背景下，覆盖作物（cover crops）作为一种可持续管理措施在全球葡萄园中的应用日益增加。覆盖作物能够防止水土流失、促进雨水入渗、增加土壤有机碳、激发土壤微生物活动和食物网，同时有助于减少温室气体排放。然而，覆盖作物的实施也可能导致葡萄产量非预期的下降，尤其是在水资源受限的地区。微生物生物刺激素（microbial biostimulants）则是另一种再生葡萄园土壤生物多样性和功能的可持续工具。它们通常含有特定的细菌和/或真菌，能够增强养分吸收效率、提高作物对非生物胁迫的耐受性，并提升作物品质。尽管行间植被可以通过提供食物和栖息地来滋养土壤微生物群落，但目前关于将覆盖作物与微生物生物刺激素作为一体化策略进行联合应用的证据仍然有限。
基于此，本研究旨在同时评估两种可持续管理策略——覆盖作物的使用以及一种具有叶面固氮能力的微生物生物刺激素（含Methylobacterium symbioticum）的应用——对土壤功能（微生物胞外酶活性和凋落物分解）、葡萄产量及品质（oBrix和酸度/pH）的影响。研究地点位于西班牙南部的赫雷斯地区（Sherry Region），供试品种为西拉（Syrah）。研究假设：（i）覆盖作物会正向影响土壤功能；（ii）固氮生物刺激素会降低与氮循环相关的微生物活性，并增强针对其他必需营养元素（如P或S）的微生物活动；（iii）覆盖作物与生物刺激素协同施用时，其有益效应最为显著；（iv）微生物生物刺激素将提升葡萄园生产力并改善作物品质，从而抵消覆盖作物可能带来的产量损失。
二、主要研究方法
- 1.
实验设计与处理：在西班牙赫雷斯地区的“兰乔德拉梅塞德”（Rancho de la Merced）实验葡萄园（隶属于安达卢西亚农业与渔业研究所IFAPA）进行。土壤类型为高钙钙积土（Hypercalcic Calcisols，粉砂质），俗称“albariza”土壤，具有高持水能力和低有机质含量（<1.5% SOM）。葡萄园于2014年定植西拉（Syrah）品种，采用双臂单干形整枝，按有机农业原则管理。实验设置两个覆盖作物水平（全年翻耕 vs. 冬春覆盖作物，覆盖作物于2018年播种zulla [Hedysarum coronarium L.]，研究期间为自生草本植物与残留zulla的混合群落）与三个微生物生物刺激素水平（无生物刺激素、1倍推荐剂量、3倍推荐剂量，生物刺激素为BlueN? [Corteva]，含Methylobacterium symbioticum SB23菌株，于2020年5月、7月和2021年6月进行叶面喷施），共六种处理组合，每种处理设八个重复（即48株目标植株）。
- 2.
土壤采样与分析：在三个时间点（2020年6月转色期、2020年8月和2021年8月收获期）采集0–20 cm土层土壤样品，共144份。测定八种水解酶的潜在活性：碳循环相关酶（β-1,4-葡萄糖苷酶BG、β-木糖苷酶XYL、β-D-纤维二糖水解酶CB、α-1,4-葡萄糖苷酶AG）、氮循环相关酶（β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NAG、亮氨酸氨基肽酶LAP）、磷循环相关酶（磷酸酶PHOS）和硫循环相关酶（芳基硫酸酯酶AS）。
- 3.
凋落物分解实验：采用茶包指数法（Tea Bag Index, TBI），将绿茶（易分解基质）和路易波士茶（难分解基质）茶包埋入土壤约90天，计算分解速率（k）和稳定化因子（S），并测定分解后茶包中的胞外酶活性。
- 4.
葡萄产量与果汁品质测定：在两个收获期（2020年8月和2021年8月）对所有目标植株进行整串采收称重，压榨后测定果汁的可溶性固形物浓度（oBrix）和pH值。
- 5.
统计分析：采用线性混合模型（linear mixed models）评估覆盖作物、生物刺激素和采样时期的主效应及交互效应，并以标准化效应量可视化结果。同时运用结构方程模型（structural equation modeling, SEM）进行系统层面的整合分析，探究各变量间的因果联系。
三、研究结果
3.1 覆盖作物对土壤胞外酶活性的促进作用
土壤胞外酶活性以LAP和PHOS为主，其次是BG，AS和NAG活性最低。所有土壤酶在较干旱的2021年活性均较低。覆盖作物的存在显著提升了三种碳循环酶（BG、CB、XYL）和两种氮循环酶（NAG、LAP）的活性，这是本研究中最为一致的效应之一。
3.2 微生物生物刺激素对土壤酶活性的影响不显著
微生物生物刺激素的添加未对土壤酶活性产生一致性的显著改变。仅在高剂量BlueN?处理下，AS活性受到下调。
3.3 覆盖作物与生物刺激素对分解参数影响有限
与土壤酶不同，分解速率（k）和稳定化因子（S）对实验处理的响应不一致，主要随季节变化。覆盖作物对k有边缘显著的提升作用，尤其在2020年6月较为明显。
3.4 凋落物酶活性对覆盖作物的响应
绿茶中的酶活性普遍高于路易波士茶。覆盖作物和生物刺激素对凋落物酶活性的影响较少且不一致。覆盖作物显著提升了绿茶中的PHOS活性和路易波士茶中的NAG（几丁质酶）活性。在2020年8月，覆盖作物与高剂量BlueN?同时施用促进了路易波士茶中AG、XYL、PHOS和AS活性的升高。
3.5 覆盖作物与生物刺激素对葡萄产量和果汁品质的交互作用
葡萄产量在第二个收获期更高。总体而言，覆盖作物对产量无显著影响，因为在2020年观察到的负面效应在2021年消失。生物刺激素的添加也未显著影响产量，但在第一年，较高剂量的BlueN?持续增加了葡萄产量（边缘显著P=0.1）。果汁的oBrix和pH值显示出覆盖作物与生物刺激素之间的交互作用：在覆盖作物存在下，较高剂量的生物刺激素诱导了更低pH值和更低糖含量的果汁（后者为边缘显著P<0.1）。
3.6 结构方程模型揭示的互补机制
系统层面的SEM支持了覆盖作物对土壤酶的普遍正向效应。SEM表明，更高的土壤活性导致了更易分解植物残体（绿茶）中更高的微生物活性，但对难分解残体（路易波士茶）的影响则更多取决于采样年份。SEM还证实了生物刺激素添加对作物产量的剂量依赖性正向效应（仅在第一年），并且生物刺激素导致的糖含量和pH值下降趋势很可能是通过提高葡萄产量间接实现的。SEM揭示了两个响应簇：一个与覆盖作物对土壤功能的有益效应相关，另一个与生物刺激素对农艺变量的直接和间接有益效应相关。
四、讨论与结论总结
讨论部分：本研究证明了覆盖作物对与养分循环相关的土壤变量（即土壤和凋落物胞外酶）具有普遍的正向效应，而固氮微生物生物刺激素对与葡萄产量和果汁特性相关的农艺变量具有依赖于年份的效应。这与先前的研究一致，表明这两种可持续策略可以同时用于恢复退化葡萄园的功能和农艺潜力。与预期相反，两种策略之间未发现明确的统计交互作用，表明它们通过对比鲜明的机制运作，分别涉及土壤过程（覆盖作物）和植物变量（生物刺激素）。然而，由于生物刺激素的应用有助于缓解第一年覆盖作物存在下观察到的轻微葡萄产量下降，因此同时考虑这两种策略对种植者特别有利，尤其是在从传统方法向更自然体系过渡的转换期。
土壤胞外酶活性因覆盖作物的存在而显著受益，这归因于植物根系释放富含碳的分泌物激发了微生物活性，以及地上和地下凋落物输入的增加为微生物提供了生长基质。相比之下，叶面施用的微生物生物刺激素对土壤酶活性无一致显著影响，这与其作用方式和所含生物体类型有关。凋落物中的酶活性普遍远高于土壤，表明凋落物输入为土壤微生物活动提供了关键热点。有趣的是，生物刺激素仅在研究的第一年提高了产量，而这一年也是覆盖作物对产量产生负面影响的年份，表明生物刺激素有助于补偿覆盖作物实施初期的产量损失。此外，生物刺激素的使用使果汁呈现出更受酿酒师青睐的特性，即较低的oBrix（从而降低酒精潜力）和较高的总酸度（可能增加葡萄酒的新鲜度和复杂性）。
本研究的结果在当前更绿色的农业政策背景下具有重要意义。但研究也存在局限性，如短期性（仅两个收获季）、单一葡萄品种（西拉）和特定土壤条件（高钙碱性低有机质土壤）。尽管如此，本研究是为数不多的同时评估覆盖作物和微生物生物刺激素对土壤功能和农艺变量影响的研究之一，提供了初步证据表明这两种策略可通过互补机制（分别促进土壤健康或植物健康）增强葡萄园的可持续性。
研究结论：本研究表明，覆盖作物的使用增强了葡萄园土壤的功能，并对土壤微生物群落处理易分解和难分解凋落物输入的能力产生了积极的连锁效应。埋藏的茶包实际上与覆盖作物终止并翻耕后掺入葡萄园土壤的植物残体高度可比。研究还证明，微生物生物刺激素的添加有助于提高葡萄产量，这对于补偿覆盖作物存在下的边缘显著产量损失尤为重要。此外，微生物生物刺激素的使用也有助于改善果汁特性，对寻求生产高品质葡萄酒的生产者具有潜在的积极连锁效应。尽管存在局限性（一个地点、一个品种、两个收获季），但研究结果强烈表明，覆盖作物与微生物生物刺激素的同步使用，对于希望向更基于自然的生产体系转型的葡萄种植者而言，可能是一种有用的策略，同时也有助于种植者适应法律法规和市场需求的更新要求。
