大肠杆菌全基因组筛选揭示增强瘤内适应性与细菌癌症治疗疗效的代谢适应机制

《Nature Cancer》：A genome?wide screen in E. coli reveals metabolic adaptations that enhance intratumoral fitness and bacterial cancer therapy efficacy

　　

尽管经过数十年的研究，使细菌能够在肿瘤微环境中繁盛的基本分子和细胞原理仍未明确。在此，研究人员通过全基因组功能筛选，鉴定了控制瘤内适应性的细菌基因和通路。靶向缺失非葡萄糖磷酸转移酶系统（phosphotransferase system, PTS），使细菌代谢偏好与肿瘤代谢物可用性对齐，可促进细菌的瘤内适应性。将多种代谢适应整合到单一肿瘤亲嗜性大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）菌株（Ec-TA）中，不仅在瘤内递送后，而且在静脉递送后，均增加了肿瘤定植，当使用经工程改造以递送编码免疫刺激载荷的Ec-TA时，抗肿瘤疗效得以提高。此外，当全身性给予Ec-TA时，它能从预先定植的肿瘤中取代野生型细菌，突显了其在存在常驻肿瘤微生物的情况下局部递送治疗药物的潜力。这些数据表明，使细菌适应肿瘤代谢微环境的独特特征，可以推动开发更安全、更有效的下一代细菌癌症疗法底盘。

尽管微生物早已被证明与癌症相关并被用作治疗剂，但细菌在肿瘤生态位中持续存在的机制仍不清楚。肿瘤形成免疫豁免、缺氧和坏死的微环境，为某些细菌提供了可据以建立瘤内群落的生态位。然而，外源性给药的细菌往往低效定植肿瘤，用于安全性的减毒突变进一步损害了靶向和持久能力。既往合成生物学改造策略缺乏基因组规模的遗传学认知，限制了疗效与普适性。为此，研究人员利用大肠杆菌全基因组条形码敲除文库开展无偏筛选，以系统鉴定控制瘤内适应性的基因和通路。

研究人员通过向皮下MC38结肠腺癌小鼠模型瘤内注射包含7,260个单基因敲除菌株的条形码敲除文库，结合体外对照和竞争感染实验，鉴定出63个敲除后损害瘤内适应性的基因以及215个敲除后增强适应性的基因。功能分类显示，前者多参与细胞膜组分合成和代谢，后者则富集于非葡萄糖分解代谢通路，尤其是磷酸转移酶系统（phosphotransferase system, PTS）操纵子。进一步研究表明，敲除非葡萄糖PTS能够提高细菌对葡萄糖的摄取与利用，从而增强瘤内适应性。研究人员将四个代谢敲除（ΔgatC、ΔprpB、ΔcaiF和ΔgabD）组合构建了肿瘤亲嗜性大肠杆菌菌株（tumor-avid E. coli, Ec-TA）。Ec-TA在瘤内和静脉注射后均表现出优于野生型的肿瘤定植能力，并能取代已定植的野生型细菌。当Ec-TA携带表达小鼠干扰素（interferon, IFN）γ的同步裂解递送系统时，在MC38模型中显著增强了抗肿瘤疗效，部分肿瘤完全消退。该研究发表于《Nature Cancer》。

主要关键技术方法包括：利用包含7,260个非必需基因敲除的条形码敲除文库（每个基因两个独立敲除菌株）进行体内筛选；通过竞争感染实验计算竞争指数（competitive index, CI）验证候选基因；使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）水平；应用RNA测序（RNA-seq）分析转录组；利用流式细胞术进行肿瘤免疫细胞分析；采用活体发光成像监测细菌定植和肿瘤负荷。小鼠模型包括C57BL/6N皮下和原位MC38肿瘤，以及BALB/c皮下CT26肿瘤；细菌背景为E. coli K-12 BW38028。

研究结果分为五个部分。

第一，用于细菌瘤内适应性的基因敲除文库筛选。通过比较瘤内选择前后各敲除菌株的丰度变化，研究人员鉴定出大量影响瘤内适应性的基因。竞争感染实验验证了筛选结果的可靠性，并发现脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）合成基因的缺失严重损害细菌瘤内适应性，其损害程度与LPS结构破坏程度相关。而氨基酸营养缺陷型突变在所用肿瘤模型中几乎不影响适应性，可能归因于肿瘤微环境提供了相应代谢物。

第二，PTS缺失增强瘤内适应性和葡萄糖利用。非葡萄糖PTS敲除菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基中生长更快，且胞内PEP水平升高。体内竞争实验表明，PTS核心转运蛋白基因缺失增强瘤内适应性，而回补实验恢复野生型表型。进一步实验证明该优势依赖于葡萄糖转运：缺失葡萄糖PTS基因可消除优势，瘤内注射葡萄糖可增强优势。转录组分析显示，敲除菌株中CRP（cAMP受体蛋白）调控的基因表达谱发生改变，表明其基础CRP活性降低，代谢更偏向葡萄糖利用。

第三，构建具有增强肿瘤亲嗜性的大肠杆菌菌株。为排除非特异性定植，研究人员在静脉注射后分析100菌株亚库在肝脏和肿瘤中的分布，结合重复筛选，最终选取涉及不同代谢通路的四个敲除基因组合构建Ec-TA。Ec-TA在瘤内及静脉注射后均显示优于野生型的肿瘤定植，且正常器官中的定植不高于野生型。非竞争性单定植实验中，Ec-TA的肿瘤细菌负荷较野生型提高约六倍。

第四，Ec-TA从预定植肿瘤中取代野生型细菌。利用表达luxCDABE的发光菌株进行竞争和取代实验，结果显示Ec-TA与野生型共注射后能抑制野生型发光信号；在预先瘤内定植野生型的双侧肿瘤模型中，静脉注射Ec-TA-lux仍能充分增殖，而WT-lux不能，表明Ec-TA可竞争性取代已存在的野生型细菌群体。

第五，跨肿瘤模型评估Ec-TA治疗效果。在CT26皮下模型和原位MC38模型中，Ec-TA的定植优势依然存在。在MC38疗效实验中，Ec-TA-IFNγ通过瘤内或静脉途径均显著减缓肿瘤生长，并出现完全缓解。免疫分析显示，Ec-TA-IFNγ治疗增加肿瘤内CD8⁺ T细胞比例及CD8⁺/CD4⁺比值，并提高IFNγ阳性CD8⁺ T细胞频率及IFNγ表达水平。

讨论部分指出，外膜和LPS合成是细菌瘤内生存的关键结构因素，而单一氨基酸营养缺陷型突变的影响很小，提示肿瘤微环境可通过代谢补偿支持某些突变体。葡萄糖代谢在瘤内适应性中起核心作用，敲除非葡萄糖PTS使细菌重新分配代谢资源以适应肿瘤代谢环境。Ec-TA作为肿瘤选择性平台，具有取代内源肿瘤微生物和高效递送治疗药物的潜力。该研究结论指出，通过靶向遗传工程使大肠杆菌适应肿瘤代谢环境，可增强其瘤内适应性和肿瘤特异性，为开发超越天然肿瘤趋向性、实现更强选择性的下一代细菌治疗底盘奠定基础。