人类肠道相关小双节病毒（picobirnavirus）确立Picobirnaviridae为RNA噬菌体的第三大分支

《Nature Microbiology》：A human gut-associated picobirnavirus establishes the Picobirnaviridae as the third clade of RNA bacteriophages

　　

小双节病毒（picobirnavirus, PBV）是在人类和动物肠道中常被检测到的RNA病毒，并与多种人类疾病相关。尽管PBV一直被认为是感染脊椎动物的病毒，但目前既无直接证据支持这一观点，也没有可用于培养PBV的系统。研究人员在此证明一种PBV可感染细菌，因此是一种RNA噬菌体。通过粪菌移植（faecal microbiota transplantation, FMT），两种不同的来自人类粪便的PBV在无菌（germ-free）小鼠体内成功扩增，建立了PBV的小鼠模型。其中一种PBV可在体外肠道厌氧细菌群落中培养，且其生长可被多种抗生素抑制。RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）显示PBV RNA存在于细菌细胞内，而对含PBV RNA细胞的富集与测序鉴定出一种此前未被识别的‘Candidatus Anaerotignum faecalis’作为其宿主。研究人员的研究结果将小双节病毒科（Picobirnaviridae）定义为除leviviruses和cystoviruses之外RNA噬菌体的第三大分支。

小双节病毒（picobirnavirus, PBV）属于小双节病毒科（Picobirnaviridae），为双节段双链RNA病毒，其第二片段编码RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）。自1988年首次在人类腹泻样本中发现以来，PBV已在人类及动物粪便、环境等样本中广泛检出，并与肠道移植物抗宿主病、HIV感染者腹泻、孕妇1型糖尿病及肠易激综合征等多种人类疾病相关联。由于人类与猪体内可检出几乎一致的PBV序列，学界曾推测其可能为人兽共患病原。然而迄今为止，既无直接证据表明PBV可感染脊椎动物，亦缺乏相应的细胞培养或动物模型以支持其增殖。此外，PBV的真实宿主长期存在争议：部分PBV基因组含有细菌核糖体结合位点（Shine–Dalgarno motif）及预测的细菌裂解蛋白结构域，提示其可能感染细菌；同时亦有研究推测其可能感染定植于动物体的真核或原核微生物。长期以来，科学界仅知leviviruses（正义单链RNA病毒）与cystoviruses（三分节段双链RNA病毒）两大RNA噬菌体分支，自1973年后近五十年间未发现新的RNA噬菌体clade，PBV的宿主归属成为亟待解决的关键科学问题。

为解决上述争议，研究人员以英国一所医疗中心炎症性肠病患者及健康对照队列中的粪便样本为来源，筛选出两株此前未报道的PBV，分别命名为PBV-18941与PBV-19022。研究人员通过建立无菌（germ-free）小鼠模型结合粪菌移植（faecal microbiota transplantation, FMT），证明这两种PBV均可在小鼠肠道内大量增殖并持续存在；进一步利用体外厌氧肠道细菌群落培养系统成功传代PBV-18941，并发现新霉素、万古霉素和甲硝唑可清除该病毒。借助RNA荧光原位杂交（RNA fluorescence in situ hybridization, RNA FISH），研究人员在细菌细胞内直接观察到PBV RNA，排除了感染真核细胞的可能。通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）富集高信号细胞并进行16S rRNA基因（V4区）扩增子测序，研究人员鉴定出一种此前未被描述的‘Candidatus Anaerotignum faecalis’为PBV-18941的细菌宿主。de novo感染实验进一步证实PBV-18941可产生具有感染性的病毒颗粒，并能在原本无PBV的细菌群落中重新开始复制周期。该研究成果发表于《Nature Microbiology》，确立了小双节病毒科（Picobirnaviridae）作为继leviviruses与cystoviruses之后RNA噬菌体的第三大分类分支，不仅将RNA噬菌体的认知从两个clade扩展至三个，也从根本上改变了机制模型中对PBV如何影响人类健康与疾病的理解，提示在肠道及其他动物样本中检测到的PBV可能通过调控细菌宿主菌群间接参与疾病过程。

本研究的样本来源于英国炎症性肠病患者及健康对照队列中两名健康供者的粪便（分别为29岁男性与68岁女性）。研究人员综合运用多项关键技术：通过二代测序（next-generation sequencing）结合cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends）获取PBV全基因组；在无菌（germ-free）小鼠中实施粪菌移植（faecal microbiota transplantation, FMT）建立体内模型，并采用定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR）动态监测病毒载量；在体外构建厌氧肠道细菌群落培养体系，通过抗生素抑制实验筛选敏感性；利用RNA荧光原位杂交（RNA fluorescence in situ hybridization, FISH）进行细胞内定位；通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）富集PBV高阳性细胞，结合16S rRNA基因（V4区）扩增子测序与宏基因组测序鉴定宿主；最后通过梯度稀释构建无PBV细菌群落并感染验证。上述体系从体内外增殖、抗生素敏感性、细胞定位到宿主鉴定及感染性确证，为PBV的噬菌体属性提供了系统性实验证据。

粪菌移植后PBV可在无菌小鼠体内扩增：研究人员将两株不同的人类粪便来源PBV分别灌胃给无菌（germ-free）小鼠，结果显示PBV-18941与PBV-19022的RNA载量均显著上升，分别增加10⁷倍与10⁶倍，并可稳定持续至23天，首次证明PBV可在哺乳动物肠道模型中增殖。

PBV-19022可在体内连续传代并被新霉素抑制：研究人员以PBV-19022阳性小鼠粪便为供体再次进行粪菌移植（FMT），该病毒在4只受体小鼠中表现出一致的生长动力学，显示其可在体内连续传代；而经新霉素处理后，PBV-19022载量急剧下降并最终被清除，提示其细菌宿主可能对新霉素敏感。

PBV可在体外培养并被抗生素抑制：研究人员将PBV阳性小鼠粪便匀浆接种于厌氧培养基中连续传代，PBV-18941成功增殖并稳定维持20代；该病毒在氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素处理后仍可生长，但新霉素、万古霉素和甲硝唑处理则可清除PBV-18941，暗示其宿主细菌可能被这些抗生素靶向。

PBV RNA定位于细菌细胞内：通过RNA荧光原位杂交（RNA FISH）检测，PBV-18941的两个节段RNA信号均与细菌通用16S rRNA探针共定位，证实PBV RNA存在于细菌细胞内，直接证明PBV-18941为RNA噬菌体。

Anaerotignum一个物种是PBV-18941的宿主：研究人员利用荧光激活细胞分选（FACS）分选出病毒信号最强的细胞群体，16S rRNA扩增子测序显示其中丰度最高的细菌扩增序列变体（amplicon sequence variant, ASV）为Anaerotignum sp.（占群落的70%）；进一步采用物种特异性RNA FISH探针证实PBV RNA仅与‘Candidatus Anaerotignum faecalis’共定位，从而确定该菌为PBV-18941的宿主。

PBV-18941对细菌的de novo感染：研究人员通过连续稀释构建四个无PBV的细菌群落，并以含PBV滤液进行攻击。结果显示其中两个群落表现出PBV-18941的活跃复制，同时伴‘Candidatus Anaerotignum faecalis’丰度下降约10倍；而另两个群落未检测到该病毒，且‘Candidatus Anaerotignum faecalis’未被发现或仅因滤液中残留DNA而检出低水平，确证PBV-18941通过产生感染性颗粒实现对无经验细菌群落的de novo感染。

讨论与结论部分指出，PBV-18941是一种感染革兰氏阳性厌氧菌‘Candidatus Anaerotignum faecalis’的RNA噬菌体，这一发现将Picobirnaviridae确立为RNA噬菌体的第三大分支，与leviruses和cystoviruses并列。鉴于PBV在人体样本中的高检出率，若所有PBV成员均为RNA噬菌体，则其将成为人体中最为丰富的RNA噬菌体，彻底改变现有认知。该研究同时指出，PBV与宿主细菌之间可在肠道环境中持续共存，其机制可能涉及物理分隔或受体相位变异等，但具体机制仍有待阐明。此外，研究揭示了‘Candidatus Anaerotignum faecalis’目前尚无法以纯培养（axenic culture）形式分离，暗示该菌可能依赖群落中的其他微生物共生生长，或生长缓慢而难以克隆化。由于PBV缺乏典型噬菌体形态特征，且基因组注释长期未提示噬菌体特异性基因，加之过去数十年RNA噬菌体研究匮乏，导致其宿主被长期误读。研究人员强调，在人体或动物样本中检测到某病毒序列，并不必然意味着该病毒直接感染脊椎动物细胞；redondoviruses等案例亦佐证了此类宿主误判的普遍性。该研究不仅为扩展RNA噬菌体生物学提供了新的范式，也为深入探索肠道病毒组（gut virome）中PBVs通过细菌宿主调控菌群及人类健康的机制奠定了实验基础。