苯硼酸配体通过靶向维管植物根组织硼酸摄取系统增强肽基mRNA递送效率

《Polymer Journal》：Phenylboronic acid ligands enhance peptide-based messenger RNA delivery into root tissues in diverse vascular plants

： 在多种植物中实现高效的核酸递送仍具挑战性，因为递送载体的性能往往依赖于植物物种和组织类型。本研究开发了基于肽的信使RNA（mRNA）负载复合胶束，其表面修饰有苯硼酸（PBA）配体，该配体设计基于维管植物根组织中保守的硼酸摄取系统。在测试的PBA配体中，安装具有较高酸解离常数（pKa）的3-甲基取代PBA显著提高了拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和本氏烟（Nicotiana benthamiana）根组织中的细胞mRNA摄取和报告基因表达，揭示了同一配体设计对单子叶和双子叶物种的适用性。PBA配体效应具有pH依赖性。所有测试的PBA衍生物在酸性条件下均增强mRNA摄取，此时PBA衍生物主要以不带电的三角形结构存在；而在碱性条件下未观察到增强效应，此时带负电的四面体形式占主导。此外，培养基中硼酸可用性的降低增加了硼酸通道（NOD26样内在蛋白5;1，NIP5;1）的表达，并伴随细胞摄取的增加。这些发现揭示了PBA配体的取代基结构和电离状态是肽基核酸载体的重要设计参数，并为在多种维管植物中拓展基于瞬时mRNA的表达技术提供了策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

外源核酸递送是支撑植物生物技术关键应用的基础技术。将遗传物质导入植物细胞已为提高作物生产力、应对粮食安全挑战做出了重要贡献，同时外源基因的瞬时和稳定表达也使植物能够作为重组蛋白、生物燃料及其他生物产品生产的平台。然而，传统的递送方法，如农杆菌介导转化和基因枪轰击，其性能往往依赖于植物物种、基因型、组织类型和实验条件。尽管多种纳米材料平台已拓展了可接受瞬时生物大分子递送的植物物种范围，但递送效率仍受载体结构、货物类型和植物物种的制约。这一局限性严重阻碍了利用多种植物物种推进植物生物技术的发展。

肽基递送载体为植物生物大分子递送提供了模块化平台，因为其货物结合、细胞穿透和内体逃逸功能可整合到明确的分子结构中。然而，肽介导的递送仍受植物物种和靶组织的强烈影响，这可能是由于不同植物系统中细胞壁结构、膜组成、摄取活性和细胞内运输存在差异。因此，提高递送效率往往需要对每种物种、组织或货物进行经验性的序列重新设计或筛选，限制了可转移递送原理的开发。因此，需要一种利用植物细胞保守生物学特征的通用策略，以减少逐物种优化并拓展肽基递送载体的应用范围。

二、研究内容与总体结论

本研究聚焦于硼转运系统作为维管植物的保守靶标。硼是维管陆生植物的必需营养素，通过鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II的硼酸酯交联参与细胞壁结构构建。硼的摄取和分布由根部转运系统调控，包括NIP家族硼酸通道（负责内流）和BOR家族硼酸转运蛋白（负责外排）。基于这一保守的硼稳态机制，研究人员设计了苯硼酸配体修饰的肽基胶束，用于在多种维管植物根组织中递送mRNA。在测试的PBA配体中，安装3-甲基取代PBA（MPBA）在拟南芥、水稻和本氏烟中均显著提高了mRNA摄取和报告基因表达，揭示了同一配体设计对单子叶和双子叶物种的适用性。研究还发现，PBA配体效应具有pH依赖性，且与植物的硼状态密切相关。该研究为拓展多种维管植物中瞬时基因表达技术提供了材料设计策略。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法开展研究：利用体外转录合成mRNA，并通过毛细管电泳评估其质量；采用两步缀合法制备mRNA负载的肽基复合胶束，首先将mRNA与Mal-TEG-(KH)₉肽以N/P比为2混合形成聚电解质复合物，再通过硫醇-马来酰亚胺缀合将携带PBA配体的(BP100)₂-Cys肽连接至胶束表面；使用圆二色光谱评估肽的二级结构；利用动态光散射表征胶束的粒径、多分散指数和ζ-电位；通过反相高效液相色谱验证缀合效率；采用共聚焦激光扫描显微镜观察Cy3标记mRNA和GFP报告基因的表达；通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）量化mRNA的细胞摄取量；利用海肾荧光素酶（RLuc）活性测定评估mRNA的翻译效率。植物材料包括拟南芥（Col-0）、水稻（O. sativa L. cv. Nipponbare）和本氏烟，均在5天苗龄时用于转染实验。

四、研究结果

1. 1.
   mRNA负载胶束的制备与表征

研究人员通过两步缀合法成功制备了PBA配体修饰的mRNA负载复合胶束。三种PBA衍生物（FPBA，pK_a 7.1；unmodPBA，pK_a 7.9；MPBA，pK_a 8.2）被修饰到(BP100)₂-Cys肽的N端。PBA修饰未显著改变(BP100)₂的二级结构，其主要为α-螺旋结构。硫醇-马来酰亚胺缀合效率为81%至88%。所有制剂的水合直径在33.8至46.5 nm之间，多分散指数为0.14至0.18。除FPBA修饰胶束的ζ-电位为+18 mV外，其余制剂的ζ-电位约为+30 mV，这与FPBA在pH 7.7下更多采用带负电结构一致。

1. 2.
   拟南芥中mRNA负载胶束的转染

在模式植物拟南芥中，共聚焦显微镜观察显示MPBA配体修饰胶束处理的幼苗呈现明显更亮的Cy3红色信号，表明MPBA配体增强了mRNA摄取。Z-stack图像证实Cy3标记mRNA被内化到根组织表面细胞层。值得注意的是，叶片中未观察到红色信号，表明PBA修饰未增加叶片摄取。qRT-PCR定量分析显示，与无配体胶束相比，MPBA配体显著增加了根组织中的mRNA摄取量。在pH 6.5条件下，所有三种PBA配体均显著增强mRNA摄取，此时PBA衍生物主要以不带电的三角形结构存在；而在pH 8.5条件下，带负电的四面体形式占主导，未观察到任何增强效应。翻译效率评估显示，MPBA配体修饰胶束处理的幼苗RLuc活性显著高于无配体胶束处理组。GFP mRNA转染后，仅在MPBA配体修饰胶束处理的幼苗中检测到清晰的绿色荧光信号。

1. 3.
   水稻和本氏烟中的mRNA负载胶束转染

将MPBA配体修饰胶束应用于水稻，结果显示与无配体胶束相比，MPBA配体使mRNA摄取量提高约2.7倍。共聚焦显微镜观察证实了根中更亮的Cy3信号。MPBA安装也增强了mRNA翻译效率，RLuc表达效率显著提高，GFP信号清晰可见。在本氏烟中，MPBA配体同样显著增加了外源mRNA摄取，共聚焦图像显示更亮的Cy3信号，RLuc和GFP表达效率均显著提高。这些结果表明MPBA配体安装在不同维管植物物种中的普适性。

1. 4.
   MPBA介导mRNA递送的硼依赖性行为

研究人员将拟南芥幼苗培养在不同硼酸浓度（50、5、0.5 μM）的培养基上，发现低硼条件（0.5 μM）下NIP5;1转录水平显著高于标准硼条件（50 μM）。与NIP5;1转录水平升高相平行，MPBA配体修饰胶束递送的RLuc mRNA摄取量在低硼条件下显著增加。竞争实验显示，在标准硼条件下生长的幼苗中，向胶束溶液中添加50 μM游离硼酸显著降低了mRNA摄取效率，而在低硼条件下生长的幼苗中未观察到显著影响。双因素方差分析检测到植物生长期间硼酸浓度与转染期间游离硼酸处理之间存在显著交互作用。尽管低硼条件下mRNA摄取增加，但RLuc表达在两种硼条件下无显著差异，表明硼缺乏可能改变了细胞生理功能。

五、讨论与结论

讨论部分指出，MPBA安装增强了三种维管植物物种中肽胶束介导的mRNA摄取和功能性报告基因表达。PBA配体效应表现出明确的pH依赖性，与硼酸的离子化状态相关。低硼条件下NIP5;1表达上调伴随胶束摄取增加，而游离硼酸的竞争性添加抑制了摄取，这些结果共同表明MPBA介导的递送与根部硼酸摄取相关过程有关。研究人员提出，由于NIP5;1只能转运低分子量硼酸而无法直接跨膜转运纳米级胶束，MPBA可能作为表面招募配体，增加胶束在参与硼酸摄取过程的根细胞表面的局部结合或停留时间，随后由细胞穿透肽结构域通过内吞或其他摄取途径驱动内化。研究还讨论了根定向递送在植物生物技术中的应用意义，因为许多农艺重要性状受根部过程调控。结论指出，PBA配体结构是通用植物核酸递送的重要材料设计参数，硼酸配体工程可能为减少逐物种载体优化、拓展维管植物中瞬时mRNA表达技术提供实用策略。