刺突蛋白第456位芳香族氨基酸残基决定SARS-CoV-2奥密克戎变异株受体结合域的功能性免疫原性

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Aromaticity at spike position 456 affects functional immunogenicity of SARS-CoV-2 Omicron variant receptor-binding domain

　　

SARS-CoV-2奥密克戎亚谱系中F456L置换的反复出现与免疫逃逸有关，但其对疫苗诱导免疫应答的影响尚不清楚。利用三聚体RBD-HR亚单位疫苗平台，研究人员探究了第456位残基如何影响受体结合域（RBD）的功能性免疫原性。研究发现，尽管F456L置换维持了相当水平的总抗原特异性IgG，但它显著降低了对多种SARS-CoV-2变异株的中和抗体应答，表明其选择性损害了功能性免疫原性而非整体抗原性。单细胞RNA测序和B细胞受体（BCR）库分析进一步揭示，F456L突变削弱了生发中心应答、减少了克隆扩增并损害了抗原特异性B细胞的库重塑。结构建模、生物层干涉法和钙通量实验证明，第456位的芳香族残基可促进有效的胚系BCR识别和激活。重要的是，用芳香族氨基酸（包括酪氨酸或色氨酸）替换非芳香族的亮氨酸，恢复了抗原激发中和抗体的能力。总之，这些发现将第456位残基的芳香性确定为RBD功能性免疫原性的关键决定因素，并展示了一个单一氨基酸置换如何重塑B细胞应答和抗体质量。这项工作为合理的疫苗抗原设计提供了重要见解，并加深了对位点特异性突变如何调控抗病毒免疫的理解。

论文解读文章

研究背景与科学问题

SARS-CoV-2的持续进化不断挑战着全球疫苗接种策略。尽管感染或疫苗诱导的中和抗体为预防重症提供了实质性保护，但携带刺突蛋白多重突变的变异株的出现，日益削弱了体液免疫的广度和持久性。在驱动病毒进化的选择压力中，增强与人血管紧张素转化酶2（hACE2）的结合亲和力以及免疫逃逸被认为是决定病毒适应性的主要因素。然而，单个氨基酸变化对刺突蛋白免疫原性——特别是受体结合域（RBD）——以及其对疫苗诱导抗体应答质量和效力的具体贡献，仍不完全清楚。

自2022年底以来，奥密克戎XBB亚谱系如XBB.1.5和EG.5.1相继主导全球流行格局。值得注意的是，这些变异株在刺突蛋白RBD的第456位仅有一个氨基酸差异：XBB.1.5携带苯丙氨酸（F），而EG.5.1携带亮氨酸（L）。相似的F456L置换在JN.1（F456）和JN.1.16（L456）变异株中也独立重现，提示该位点可能是一个适应性热点，使病毒能在强体液免疫压力下调节其抗原特性。先前的研究已观察到F456L与增强的免疫逃逸相关，但这一单一置换影响功能性免疫原性（即诱导稳健、高质量B细胞应答的能力）的机制基础尚不明确。为此，研究人员利用前期建立的RBD-HR疫苗平台，系统探究了第456位残基对RBD功能性免疫原性的影响。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

关键技术方法

研究人员采用了整合性分析方法。首先，利用杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac）在昆虫Sf9细胞中表达并纯化了三聚体重组RBD-HR蛋白，并通过高效液相尺寸排阻色谱（HPSEC）和差示扫描荧光法（DSF）验证了蛋白的均一性和热稳定性。随后，将纯化蛋白与MF59样佐剂混合，对雌性NIH小鼠进行两剂次肌肉注射免疫，并在第35天采集血清进行中和抗体检测，包括活病毒和假病毒中和试验。为深入探究B细胞应答，研究人员通过流式细胞术分选脾脏中的RBD特异性B细胞，进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和B细胞受体（BCR）库分析。此外，还运用了生物层干涉法（BLI）测定抗原-抗体结合动力学，以及钙通量实验评估B细胞活化水平。结构建模方面，使用了AlphaFold3和Rosetta Flex ddG进行计算机模拟预测。

研究结果

F456L突变损害RBD-HR疫苗诱导的中和免疫原性

研究人员制备了源自XBB.1.5（F456）和EG.5（L456）毒株的重组三聚体RBD-HR蛋白，两者RBD序列仅在456位有F到L的差异。免疫后中和抗体检测显示，携带F456L置换的RBD_EG.5-HR疫苗诱导的中和抗体滴度显著低于RBD_XBB.1.5-HR疫苗。针对XBB.1.5和JN.1活病毒的几何平均滴度（GMTs）在F456组分别为2438和768，而在L456组均降至检测下限。对一系列假病毒的检测也证实了这一现象。此外，EG.5疫苗诱导的滤泡辅助性T细胞（Tfh）、生发中心（GC）B细胞、记忆B细胞和抗原特异性抗体分泌细胞数量均显著减少。在JN.1/JN.1.16体系中重复实验得到了一致结果。在全长刺突蛋白疫苗背景下，虽然EG.5疫苗也呈现下降趋势，但未达到统计学显著性，这可能是由于全长刺突蛋白激发了更广泛和异质的抗体库。

F456L置换削弱原型RBD-HR疫苗诱导的中和抗体应答

为排除其他共突变的影响，研究人员将单一的F456L突变引入野生型（WT）RBD背景。结果显示，即使在其他抗原背景完全一致的情况下，RBD_F456L-HR疫苗对所有测试的原型假病毒诱导的中和抗体滴度均显著降低。这表明F456L置换本身足以严重损害中和抗体的产生，但该效应小于在奥密克戎变异株中观察到的幅度，提示自然变异株中存在的其他共突变（如N450D、N460K或R346T）共同放大了免疫逃逸效果。

第456位芳香族氨基酸增强中和抗体应答

鉴于非芳香族的L456导致中和抗体滴度大幅下降，研究人员探究了将其替换为其他芳香族氨基酸（酪氨酸Y或色氨酸W）是否能恢复免疫原性。在EG.5背景下构建的RBD_EG.5-HR(L456Y)和RBD_EG.5-HR(L456W)疫苗，相比L456组，对所有测试假病毒的中和抗体滴度均显著提升。这种恢复作用不仅限于针对携带F456的变异株，对携带L456的变异株同样有效，表明第456位芳香族残基赋予的免疫增强效应具有广泛适用性。

单细胞BCR库分析揭示F456L突变损害克隆选择

通过对分选的RBD特异性B细胞进行单细胞RNA测序和BCR谱系分析，研究人员鉴定出11个转录不同的B细胞群。与L456免疫组相比，F456免疫组中浆母细胞（PB）、生发中心B细胞（暗区GCB_DZ和明区GCB_LZ）以及记忆B细胞的比例更高。尽管两组在CDR3长度分布和总体IGHV基因使用谱上相似，但F456免疫组的BCR库呈现出更聚焦的克隆模式，优势克隆扩增更显著；而L456组则呈更弥散的多克隆分布。莫里西塔重叠指数分析表明，F456免疫显著诱导了库重塑，使其偏离初始基线，而L456免疫则保留了更多与初始库的相似性。这些结果表明F456抗原能更有效地促进生发中心微环境中的克隆选择和亲和力成熟。

F456塑造中和抗体库

尽管F456L显著降低了中和抗体滴度，但总结合抗体水平并未改变，说明该突变特异性地损害了功能性中和抗体的诱导，而非整体抗体产量。通过对20种已知结合F456位点的单克隆抗体进行接触分析，发现F456是抗原-抗体相互作用的关键热点。竞争性ELISA实验进一步证实，与RBD_F456L-HR免疫血清相比，RBD_WT-HR免疫血清能更有效地与F456依赖性单克隆抗体（如Omi-42和CC12.3）竞争结合F456抗原。定量分析显示，F456对整体中和活性的贡献显著大于L456，而对照抗体（不接触456位点的S309和P2B-2F6）则无此差异。这揭示了F456L突变导致了抗体库功能性组成的转变。

第456位芳香族氨基酸增强抗原-BCR结合并促进B细胞活化

计算机模拟预测显示，将F456替换为非芳香族残基（L或S）会显著破坏抗体-抗原界面的稳定性，而芳香族替换（Y或W）则基本保持稳定。结构分析表明，F456作为芳香族互作热点，通过π-π堆积作用与胚系BCR重链上的F99残基相互作用。生物层干涉法（BLI）实验证实，胚系CC12.3抗体与RBD_F456L-HR的结合亲和力（K_D）比与RBD_WT-HR的结合弱3.6倍，而不接触456位点的胚系S309抗体则无差别。钙通量实验进一步表明，无论免疫背景如何，含F456的抗原均能诱导更强的钙动员信号，表明芳香族残基促进了更有效的BCR交联和B细胞活化。

总结与讨论

本研究强调了第456位氨基酸从芳香族（F）变为非芳香族（L）对RBD功能性免疫原性的重大影响。F456L突变减少了靶向第456位残基的中和抗体的产生，并损害了BCR对抗原的识别。然而，这种减弱可以通过将非芳香族氨基酸替换回芳香族氨基酸来补偿。该工作为理解特定突变如何影响抗原功能性免疫原性提供了宝贵见解，并为未来疫苗设计提供了指导。研究结论指出，F456L置换显著降低了RBD的功能性免疫原性，表现为中和抗体应答减弱、生发中心活性降低和B细胞库多样性受限，而芳香族残基的存在是维持有效BCR识别和B细胞激活的关键。这些发现强调，在更新疫苗抗原以应对快速进化的变异株时，除了追踪中和测定中的抗原逃逸，仔细评估功能性免疫原性至关重要。最终，理解刺突蛋白序列变异与宿主免疫识别之间微妙的相互作用，对于预测病毒进化和优化下一代COVID-19疫苗具有重要意义。