《Scientific Reports》：Validation of a deep neural network workflow for fully automated dicentric chromosome analysis in biological dosimetry
编辑推荐：
人工智能（AI）近年来已进入生物剂量学领域。本研究验证了由MetaSystems公司实现的深度神经网络（DNN）工作流初版，用于在显微图像中检测双着丝粒染色体和多着丝粒染色体。验证通过参数优化、校准曲线生成及独立测试完成。研究人员对定义畸变类别的类分数（
人工智能（AI）近年来已进入生物剂量学领域。本研究验证了由MetaSystems公司实现的深度神经网络（DNN）工作流初版，用于在显微图像中检测双着丝粒染色体和多着丝粒染色体。验证通过参数优化、校准曲线生成及独立测试完成。研究人员对定义畸变类别的类分数（class score）参数阈值进行了优化，通过减少假阳性双着丝粒染色体，同时平衡假阴性检测的影响（尤其在高剂量下），使DNN评分在低剂量下（??Co数据集）更接近人工评分。尽管数值略高，DNN在对照组中获得了可接受的双着丝粒染色体产率。校准曲线的比较显示，DNN曲线介于人工曲线与半自动曲线之间。基于两个不同实验室的独立测试数据集（X射线）所建立的DNN曲线显示出高度一致性，全部12/13个测试样本的剂量估算值均精确匹配参考剂量，即使在低剂量和分类（triage）评分模式下也是如此。该DNN工作流能够为不同辐射品质建立校准曲线，并成功完成剂量估算，有望替代半自动评分，并在大规模放射性或核事件中提升生物剂量学实验室的应急能力。
## 论文解读
**研究背景与问题** 生物剂量学是电离辐射意外暴露后,在个体水平上独立检测与估算剂量的方法,依托外周血中的生物标志物,为放射性及核事件后的应急准备与响应提供支持,并可开展个体剂量重建,同时服务于受照人员的分类(即分诊与医学处置)。目前已建立多种检测方法,其中双着丝粒染色体分析是现行"金标准"。双着丝粒染色体是电离辐射所致DNA双链断裂后错误修复的终产物,可在淋巴细胞中期分裂相中经光学显微镜识别。该细胞遗传学检测通常需在500–1000个中期分裂相中计数双着丝粒染色体,并借助离体校准曲线换算剂量;该方法耗时,且依赖技术娴熟、经验丰富的人工评分员,因此必须在专业实验室内完成。首批结果一般在血样送达实验室后2.5天给出初步剂量估算,精确估算可达一周,视人员配置而定。然而大规模放射性或核事件一旦发生,单一实验室的检测能力很快饱和。近十年来,多项研究致力于加速与自动化流程或改良评分程序。自动化的一个途径是实现显微图像分析与双着丝粒染色体检测的自动化;Metafer平台软件(含自动中期相查找MSearch、图像采集AutoCapt及基于经典非AI图像处理的DCScore检测)是生物剂量学实验室广泛使用的商业工具,但应用于剂量估算时通常建议采用半自动模式,由人工核验候选双着丝粒染色体以剔除假阳性,尤其是低剂量情形;研究亦表明半自动校准曲线的双着丝粒产率低于人工曲线,半自动评分数据常出现过散布(overdispersion),且玻片质量可影响检测效率。尽管如此,多项研究与实验室间比对仍支持该方法在大规模事件中用于粗略剂量估算、分诊与伤员分类的优势。AI在图像分析与模式识别方面的天然优势,使其在实现全自动评分方面潜力巨大,多个研究组近期已在深度神经网络(DNN)的实现与验证上取得进展。本研究旨在验证MetaSystems实现的第一版基于DNN的双着丝粒染色体检测工作流,具体目标包括:利用数据集优化定义畸变类别的类分数阈值并生成全自动校准曲线;通过与人工及半自动评分比较评估其性能;并利用来自两个不同实验室的非盲独立数据集建立DNN校准曲线,以检验其在生物剂量学中的适用性,包括在全评分与分诊评分模式下对测试样本进行剂量估算。
**关键技术方法** 作者采用两个前后衔接的DNN:(1)基于U-Net的分割网络,在原始中期相图像中分割单个染色体,训练于来自德国联邦辐射防护局(BfS)的6200幅Giemsa染色中期相图像,并自动剔除次级中期相或非主中心中期相的染色体;(2)基于VGG16的分类网络,将分割对象分为九类(正常染色体、双着丝粒、多着丝粒、着丝粒/无着丝粒环、断片、染色体与染色单体断裂、染色体与染色单体裂隙、伪影对象及姐妹染色单体交换),训练对象共718927个,其中575138个用于训练、71893个用于验证、71896个用于测试;训练数据来自七个机构(包括BfS、德国联邦国防军放射生物学研究所BIR、波兰核化学与技术研究所INCT、以色列卫生部、哈萨克斯坦共和国国家核中心、Merck Healthcare KGaA及一个匿名来源),伪影类主要用于防止分割错误对象被误判为畸变。DNN最终输出为从分割中期相中提取的对象图像及其类分数(归一化至[0,1]的模型置信度)。实验数据方面:优化数据集为BfS的??Co校准曲线图像(N=86750)及对应测试样本图像(N=18848),血样于德国联邦物理技术研究院(PTB)用??Co源离体照射,剂量以空气比释动能计为0–5.69 Gy(曲线)与2.56、3.41、4.54 Gy(测试样本),剂量率31.64 Gy/h;独立测试数据集包括BfS的195 kVp X射线曲线(N=54570)与测试样本(N=9934),以及英国卫生安全局(UKHSA)的250 kVp X射线曲线(N=23345)与测试样本(N=5588),后者分诊模式约分析130个细胞、全评分模式超过2000个细胞。图像经Metafer扫描系统采集。统计分析中排除对象数<39或>54的中期相,并对各类分数设定阈值t以排除s
**研究结果**
*Parameter optimisation of the DNN workflow*(DNN工作流的参数优化):低剂量下DNN检出的假阳性双着丝粒对平均双着丝粒数影响较大;对双着丝粒、多着丝粒与断片施加类分数阈值可减少假阳性但增加假阴性。以精确率≥80%且平均F1分数最大为准则确定阈值0.9,该值使DNN评分在低剂量下更接近人工评分;该数据集对照样本中DNN双着丝粒产率为每1000细胞2.26,接近人工评分的1.33;剂量≤0.5 Gy时精确率、准确率与特异度均>85%,但召回率(20–50%)与F1分数(33–67%)有时偏低。
*Calibration curves and dose estimation of the optimisation dataset*(优化数据集的校准曲线与剂量估算):在<240 mGy的所有剂量下DNN产率略高于人工评分,≥240 mGy时低于人工评分;与人工评分相比,DNN模型的截距略高(p=0.083),线性与线性二次系数显著更低(p=0.025,p<0.0001);与半自动评分相比截距和线性系数无显著差异(p>0.05),但线性二次系数显著更高(p<0.0001)。DNN曲线在95 mGy与对照值无显著差异(p>0.05),在240 mGy(p=0.0006)与470 mGy(p<0.0001)显著升高。基于3个测试样本(2.56、3.41、4.54 Gy)的18848幅图像,3/3(100%)的95%置信区间包含参考剂量;>2.5 Gy时曲线数据离散度显著大于1,提示低剂量近似泊松分布而高剂量不成立。
*DNN-based calibration curves and dose estimation of test samples of the independent test datasets*(独立测试数据集测试样本的DNN校准曲线与剂量估算):BfS与UKHSA两条X射线曲线在截距、线性及线性二次系数上均无显著差异(p>0.05);BfS曲线首个可与未照射对照显著区分的剂量为260 mGy(p=0.0003),UKHSA为250 mGy(p=0.04)。BfS数据4/5(80%)测试样本的95%置信区间包含参考剂量,未包含者的置信区间上限仅比参考剂量低20 mGy;UKHSA数据7/7(100%)包含参考剂量;两实验室对照值与两个<0.5 Gy剂量(0.3与0.4 Gy)的参考剂量均落入置信区间,其中0.3 Gy样本的双着丝粒计数与对照无显著差异,但仅计数130个细胞导致不确定性较大、置信区间较宽。两条X射线曲线的β系数均显著高于??Co曲线(BfS:p<0.0001;UKHSA:p=0.008),人工与半自动评分中亦见类似趋势;两个X射线数据集在高剂量下均显示显著过散布。
**讨论与结论** 讨论指出,全自动评分算法通过在低剂量与对照中减少假阳性(阈值0.9模拟半自动评分中人工剔除假阳性的做法),使DNN评分可与人工评分相比,但高剂量下假阴性影响增大,产率低于人工评分;文献报道未照射对照的双着丝粒产率约为每1000细胞1–2个,本优化数据集中人工与半自动评分分别为1.33与1.76,DNN虽略高(2.26)但可接受;DNN在对照中意外检出1个含5个双着丝粒的细胞,人工复核证实该结果,提示对照差异部分源于该"异常"细胞。阈值>0.9虽可降低对照产率,但会损失真阳性并进一步降低召回率与准确率,且算法更新后阈值需重新评估;本研究DNN的C值(0.0011–0.0026)远低于其他研究报道的DNN校准曲线(0.0091–0.084)。类分数阈值结合对象数固定范围会剔除染色体数异常或含无着丝粒断片的细胞(如离焦、染色体凝集过度或染色单体分离强烈),提示未来算法应在图像处理前加入质量评估。DNN曲线较半自动曲线更接近人工曲线,但检测限可能因假阳性增多而略高,三条DNN曲线可区分的最低剂量约为250 mGy;测试样本(2.5–4.5 Gy)剂量估算与参考剂量完全一致。两实验室X射线曲线高度一致,12/13个测试样本在0–5.1 Gy范围内与参考剂量相符;UKHSA曲线略高且对照值略低,可能与采集前的中期相质量排序有关。X射线与??Co曲线的差异在人工与半自动评分中同样存在,可能源于所用X射线(平均光子能量80–100 keV)相对生物学效能略高于??Co,与文献一致;两实验室X射线曲线的高度吻合提示统一DNN算法与可比设备有望改善实验室间可比性、克服各实验室单独建曲线的难题,但仍需进一步研究。UKHSA测试样本约130个细胞的剂量估算表明全自动评分亦可成功用于分诊分类。研究局限包括:所验证工作流为初版,需后续严格验证,未来版本(如加入质量评估DNN)阈值将改变;部分优化数据曾用于训练,可能带来乐观偏倚;独立数据虽来自两实验室,但均为受控条件且设备相当,玻片制备、图像采集与质量等差异可能影响结果,未来应以多实验室、不同图像质量的数据验证。与半自动评分相比,全自动评分节省的时间有限,但其关键优势在于彻底消除人工交互:人员可专注于制备更多样本,配合玻片匣与自动中期相检测采集可昼夜不间断循环分析,且维护与分析人员无需具备双着丝粒分析经验;鉴于研究现状,目前不建议将任何DNN算法无监督用于诊断目的,尚需进一步验证并考虑伦理、安全与法律问题。文章结论为:本研究通过参数优化、校准曲线生成与独立测试,验证了MetaSystems基于DNN的工作流初版用于双着丝粒染色体全自动评分;该初版可利用类分数阈值检测不同染色体畸变,为不同辐射品质建立校准曲线,并在全评分与分诊评分模式下对来自两个不同实验室的独立数据成功完成剂量估算;但存在局限,亟需更多来自不同实验室的独立数据集进一步验证;全自动评分有望在未来替代半自动评分,将该工作流整合进现有成像系统可实现从成像到评分的一致流程,未来加入质量评估DNN并改进中期相分割与无着丝粒检测,可进一步提升工作流性能与结果可靠性。
