《Scientific Reports》：Diurnal variation of islet autoantibody titers in established type 1 diabetes suggests restricted-time sampling improves aab measurement and detection
编辑推荐：
1型糖尿病（T1D）中胰岛自身抗体（Aab）的昼夜变异仍知之甚少，且可能阻碍新疗法的开发、验证与优化。研究人员旨在描述胰岛自身抗体的昼夜变异程度与模式，并在发现显著变异后将其转化至临床情境。研究人员在已确诊T1D的人类受试者中开展了两项研究：（1）一项前瞻性研
1型糖尿病（T1D）中胰岛自身抗体（Aab）的昼夜变异仍知之甚少，且可能阻碍新疗法的开发、验证与优化。研究人员旨在描述胰岛自身抗体的昼夜变异程度与模式，并在发现显著变异后将其转化至临床情境。研究人员在已确诊T1D的人类受试者中开展了两项研究：（1）一项前瞻性研究（n=10），考察个体内胰岛自身抗体与免疫球蛋白的每日变异范围；（2）一项独立的回顾性横断面研究（n=705），考察采样时间对临床情境下Aab滴度及检出的影响。研究发现，部分个体在一天内存在较大的Aab变异，且可超过预期的批间变异水平。对某些Aab而言，该变异呈昼夜节律（circadian）模式。研究还发现，在临床情境中，限时采样可在特定年龄组内提高IA-2A与ZnT8A的检出。研究人员结论认为，限时采样有望改善放射结合法（Radiobinding）测定的Aab作为生物标志物在疾病修饰疗法开发与监测中的应用，以及在已确诊T1D中制定胰岛移植策略的应用。在疾病早期阶段，尚需对Aab昼夜变异及限时采样开展进一步研究。
**研究背景与问题**
1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）由针对产胰岛素胰岛β细胞的自身免疫攻击所致，导致内源性胰岛素生成减少，2021年全球估计有840万人患病，构成重大全球健康负担。现有疗法主要限于持续补充胰岛素，但疾病修饰干预已进入临床（如teplizumab用于延缓2期糖尿病临床发病），更多疾病修饰疗法及改进的胰岛细胞移植/替代策略也在酝酿中，其目标均为保护β细胞功能。胰腺胰岛自身抗体（islet autoantibodies，Aab）是T1D的既定生物标志物，2种及以上Aab阳性者10年内发病风险约70%，终生风险接近100%；Aab的种类与所识别β细胞抗原数量亦与内源性胰岛素分泌的有利或不利影响相关，并被视为治疗疗效的早期生物标志物（如DIAGNODE-3试验以GAD65 Aab滴度作为抗原特异性免疫应答标志物）。干细胞移植（如VX-880）亦提示Aab测定可用于移植患者筛选与术后自身/同种免疫监测。因此，Aab的精准测定对疗法开发、验证与移植安全至关重要。国际Aab标准化项目已显著改善测定精度，减少了批内与实验室间变异，但未涉及另一变异来源——一天中不同时间采血引入的"昼夜变异"。已知人类免疫系统存在昼夜变异，研究人员既往工作亦显示与T1D相关的免疫细胞群（包括分泌抗体的B细胞）呈昼夜变异，故推测胰岛Aab亦可能呈昼夜变异。本研究即旨在确定免疫球蛋白与胰岛Aab是否存在昼夜变异，以及该变异是否影响T1D中Aab检测的敏感性，从而寻找可提高Aab检出率、增加新疗法开发验证成功率的采样时间。
**主要关键技术方法**
研究包含两项：其一为前瞻性"昼夜变异研究"，纳入10例18–40岁、胰岛素治疗≥12个月的T1D患者，自09:00起每4小时静脉采血一次、持续24小时，以ELISA测定免疫球蛋白同种型，以放射结合法（radiobinding assay，RBA）双份测定胰岛素抗体（IA）、GAD65抗体（GADA）、IA-2A及锌转运体8抗体（ZnT8，含精氨酸ZnT8RA与色氨酸ZnT8WA变体），并设9例非T1D历史对照；采用Cosinor余弦模型（基于个体z分数）、方差成分分析与自助法模拟分析变异来源及限时采样对精度的影响。其二为回顾性横断面"采样时间研究"，样本来自Benaroya Research Institute（BRI）糖尿病登记与标本库（n=705，每人单次采血，采样时间中位数11:00，范围7:00–16:00），Aab于Barbara Davis Center以RBA测定，采用分类回归树（CART）机器学习结合ANOVA与卡方检验分析年龄-采样时间亚组。
**研究结果**
*免疫球蛋白昼夜变异*：所有免疫球蛋白（IgM、IgG1-4、IgA1-2）均呈统计学显著的昼夜节律变异，除IgA1外多在正午（12:00）达峰，IgA1峰值约在9:48；历史对照中仅IgM、IgG2与IgA1显著，IgA1峰值约12:06，与T1D组差异未达统计学显著。
*胰岛自身抗体昼夜变异*：部分T1D个体全天Aab波动明显，个体内日间极差差异很大，如GADA日差一人为0、另一人高达900单位；中位日差IA约19单位、GADA约30单位、IA-2A约0.6单位。部分个体IA-2A、GADA与IA的"检出"状态随一天时间改变，且其昼夜变异系数（CV）超出批间CV数倍（IA-2A为2.07倍、GADA为2.14倍、IA为4.34倍）；IA、ZnT8RA与ZnT8WA呈显著昼夜节律，GADA与IA-2A未达显著。方差成分分析显示个体间变异最大，但采样时间所致变异对GADA、IA与ZnT8WA的贡献大于批内变异。限时采样可提高精度，如13:00采样使GADA、IA、ZnT8RA的标准差分别降低23%、9%与34%。
*采样时间研究*：机器学习显示年龄是影响Aab水平的最主要因素，其次为采样时间，后者对IA-2A与ZnT8A平均对数滴度有显著影响（对GADA无）。多数亚组中较早采样滴度更高：14–19岁儿童14:00前采样IA滴度增加2.64倍（p=0.0097）；≤16岁及17–42岁者08:00前采样IA-2A滴度分别增加3.49倍（p=0.0051）与2.03倍（p=0.0369）；≤15岁者09:00前采样ZnT8A滴度增加2.01倍（p=0.0243）。亦有例外，如≥44岁者09:00前采样IA呈0.44倍变化（反推09:00后增加2.27倍），26–57岁者14:00前采样ZnT8A呈0.31倍变化（反推14:00后增加3.23倍）。检出率方面，≤16岁（91% vs 64%，p=0.0022）与17–42岁（61% vs 48%，p=0.0442）08:00前采样IA-2A检出率显著升高；≤15岁09:00前采样ZnT8A检出率升高（71% vs 54%，p=0.0134）；26–57岁者14:00后采样ZnT8A检出率幅度更大但未达显著（44% vs 28%，p=0.1332）；IA检出率未见显著改变。
**讨论与结论**
讨论指出，部分4期T1D个体免疫球蛋白与胰岛Aab全天变异较大，有时足以改变检出状态；群体层面上免疫球蛋白同种型、IA与ZnT8A呈显著昼夜节律；独立大样本中机器学习识别出特定年龄组内可提高IA-2A与ZnT8A滴度及检出率的采样时间。因此限制外周血采样时段可减少昼夜变化来源的Aab变异，提高测定精度进而增强临床试验效能，并提高研究产出；基于年龄的限时采样还可提高部分Aab检出，有望改善Aab作为疾病修饰疗法开发监测及胰岛移植人选标准的生物标志物应用，但仍需进一步研究。作者说明机器学习算法旨在寻找平均对数滴度差异最大的采样时间，对检出率并不知情，故检出率结果不因模型过拟合偏倚而夸大，并以10折交叉验证评估了统计误差。对最佳采样时间的解释方面，年龄-采样时间亚组与病程的混杂被排除（各组平均病程无显著差异）。免疫系统昼夜变异主要由组织昼夜节律钟基因及经视交叉上核的环境同步驱动，胰岛细胞生物钟调控胰岛素胞吐等过程，故Aab昼夜变异可能反映昼夜调控的抗原释放变化；IA变异亦可能部分反映外源胰岛素影响，但数据未含胰岛素给药时间，属局限。自身抗体半衰期长而血中水平变化可能与Fc受体结合相关（Fc受体呈昼夜表达并可结合胰岛Aab）；水合状态变化不足以解释所观察差异。关于测定变异，超过半数受试者GADA、IA-2A与ZnT8WA的昼夜变异超出实验室预期；由于Aab检测改变者滴度均接近阈值，变化或部分源于批内统计变异，但方差成分分析提示采样时间所致变异占比更大，建议滴度距阈值2个标准差内的受试者复测。局限包括昼夜变异研究样本小且异质（受24小时研究单元费用与负担限制，但足以检出多种Aab的显著节律）、采样时间研究为横断面单次观察、CART模型未纳入病程、年龄与采样时间及滴度存在相关性（年轻者采样较晚且滴度较高，该混杂本应使结果偏向"较晚采样有益"，而多数亚组并非如此），以及结论仅适用于放射结合法测定，其他平台（荧光素酶免疫沉淀、ADAP、ECL、ELISA、CLIA、Luminex等）需进一步验证；昼夜变异究竟源于测定变异还是真实生物学变异尚待明确，但即便仅为测定变异，也已证实个体可在24小时内获得/失去抗体，故阈值附近应多次测定。研究结论为：应在限定的时间窗内测定自身抗体，以减少昼夜变异影响、提高研究敏感性与产出；建议采用通用的"标准化采样时间窗"以保证跨研究可比性，替代方案为设定随时间变化的Aab阳性阈值以反映群体水平的昼夜分布变化；上述结论需独立验证，并期待在T1D筛查人群中进一步优化标准化时间采样（其最佳采样时间可能与4期T1D人群不同）。
