局部白蛋白过量通过促进白色念珠菌致病性加剧外阴阴道念珠菌病的NLRP3炎症小体激活与高炎症反应

《Nature Communications》：Local albumin excess exacerbates Candida albicans-induced inflammasome activation linked with hyperinflammation during vulvovaginal candidiasis

　　

外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal candidiasis, VVC）是一种主要由白色念珠菌（Candida albicans）引起的黏膜酵母感染，其症状由炎症驱动。VVC的发病由白色念珠菌的致病性触发，但疾病驱动性高炎症的潜在原因仍未完全阐明。研究人员发现，复发性外阴阴道念珠菌病（Recurrent VVC, RVVC）女性及小鼠实验性VVC期间阴道白蛋白浓度均升高。这些白蛋白水平与阴道灌洗液中的炎症细胞因子呈相关性。尽管该血清蛋白在阴道的丰度可作为炎症诱导的血管通透性的标志，研究人员还揭示了白蛋白也能驱动炎症的分子机制。白蛋白可增强人巨噬细胞在白色念珠菌刺激下的NLRP3（NOD样受体家族pyrin结构域包含蛋白3）炎症小体激活。在白蛋白存在下，白色念珠菌对巨噬细胞介导的清除的抵抗力增强。此外，白蛋白可增加真菌分泌型天冬氨酸蛋白酶1（secreted aspartic protease 1, Sap1）的表达，研究人员确定该效应分子是体外及体内VVC模型中驱动炎症小体激活和IL-1β（白细胞介素-1β）应答的效应物。而且，在白蛋白存在下，中性粒细胞对白色念珠菌的清除也受到损害。综上所述，阴道白蛋白不仅是阴道黏膜炎症的后果，还可驱动白色念珠菌诱导的高炎症IL-1β应答，这构成了VVC的免疫病理基础。

外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal candidiasis, VVC）是女性生殖道最常见的感染之一，70–75%的健康女性一生中至少经历一次。对于每年多次发作的复发性外阴阴道念珠菌病（Recurrent VVC, RVVC）患者，生活质量受到严重影响。VVC症状由针对念珠菌属（主要为白色念珠菌）的黏膜感染的炎症反应驱动。该炎症反应虽由真菌致病性引发，但其持续存在及症状发展部分依赖于中性粒细胞应答，而该过程受NLRP3（NOD样受体家族pyrin结构域包含蛋白3）炎症小体调控。招募至外阴阴道黏膜的中性粒细胞在真菌清除方面功能失调，并导致免疫病理损伤。尽管NLRP3炎症小体激活与VVC的关联已被确认，但驱动该疾病特征性高炎症反应的具体机制尚未完全阐明。雌二醇（Estradiol）作为女性体内主要雌激素形式，可增加女性生殖器官的血管通透性；而急性炎症反应可进一步加剧血管通透性，导致血清中最丰富的蛋白质——白蛋白渗入阴道液及宫颈分泌物中。既往研究表明，白蛋白可诱导白色念珠菌和格特乳酒念珠菌（Candida glabrata）产生增强其对上皮细胞致病性的适应性改变；但同时，白蛋白也可中和念珠菌溶素（candidalysin），后者是VVC相关炎症和炎症小体激活的关键驱动因子。因此，尽管炎症期间阴道内存在白蛋白，其在VVC炎症发病机制中的确切作用仍不清楚。基于阴道白蛋白水平与RVVC患者及VVC小鼠模型中炎症反应的相关性，研究人员开展本研究以验证白蛋白是否不仅是炎症的被动标志物，更是驱动C. albicans诱导的高炎症反应的主动机制。

研究人员通过整合RVVC患者队列（包括RVVC1队列的13例患者与9例健康对照，以及RVVC2队列的102例多中心RVVC患者）的临床样本与β-雌二醇（β-estradiol）预处理的小鼠VVC模型，结合体外人单核细胞来源巨噬细胞（human monocyte-derived macrophages, hMDMs）、人外周血中性粒细胞、阴道上皮细胞系及多种基因敲除/突变株的分子生物学实验，系统研究了白蛋白在VVC中的作用。研究结论表明，阴道局部白蛋白过量并非仅是炎症所致血管通透性增加的结果，而是可通过增强白色念珠菌的致病性来驱动NLRP3炎症小体依赖性高炎症反应的关键因素。该研究成果发表于《Nature Communications》，为理解RVVC的免疫病理机制提供了新视角，并提示白蛋白-Sap1-炎症小体轴可能是干预VVC过度炎症的潜在靶点。

研究人员主要依赖以下关键技术方法：临床样本分析采用两个独立RVVC患者队列（RVVC1队列含13例患者与9例健康对照，RVVC2队列含102例多中心RVVC患者），通过酶联免疫吸附试验（ELISA）与Luminex多因子检测分析阴道灌洗液中白蛋白及细胞因子水平；动物实验采用8周龄C57BL/6J小鼠建立β-雌二醇预处理的小鼠VVC感染模型；体外机制研究综合运用人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）、小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）、人原代中性粒细胞及阴道上皮细胞系（A-431、SW954），结合流式细胞术、活细胞成像、Seahorse代谢分析、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及免疫荧光组织化学等技术；利用多种C. albicans基因缺失突变株（如sap1ΔΔ、ece1ΔΔ、efg1ΔΔcph1ΔΔ、cat1ΔΔ等）及Nlrp3^-/-、Pycard^-/-、Casp1^-/-/Casp11^-/-、Gsdmd^-/-等基因敲除小鼠源巨噬细胞进行功能验证；并采用重组Sap1（rSap1）、合成念珠菌溶素及多种炎症小体抑制剂（如Anakinra、KCl、VX-765、Pepstatin A、Cytochalasin D）明确分子机制。

在"Vaginal albumin levels are linked to inflammation during VVC"部分，研究人员通过检测健康女性与RVVC患者阴道灌洗液，发现RVVC患者白蛋白相对丰度显著升高，且与促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17及中性粒细胞趋化因子IL-8水平呈显著正相关；在小鼠VVC模型中，感染后阴道灌洗液及黏膜组织白蛋白水平显著升高，并与IL-1β浓度、髓过氧化物酶（MPO）水平及中性粒细胞数量相关。

在"Albumin potentiates innate inflammatory responses"部分，研究人员发现白蛋白在不同阴道上皮细胞系（A-431、SW954）中不影响或降低C. albicans诱导的某些细胞因子释放，但在人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）中显著增强IL-1β、IL-1Ra、IL-8和IL-6的释放；即使使用IL-1受体拮抗剂（Anakinra）阻断IL-1β自放大环路，白蛋白仍能增强IL-1β释放；此外，白蛋白可阻止人原代中性粒细胞对IL-1β的降解。

在"Albumin enhances C. albicans-induced NLRP3 inflammasome activation"部分，研究人员证实白蛋白可增加脂多糖（LPS）预处理的hMDMs及BMDMs中C. albicans诱导的IL-1β和IL-18释放；钾外流抑制剂KCl及caspase-1抑制剂VX-765均可阻断该效应；利用表达荧光Citrine偶联凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的reporter小鼠，观察到白蛋白存在下ASC specks（炎症小体聚合体）增多；Nlrp3^-/-、Pycard^-/-（ASC）、Casp1^-/-/Casp11^-/-的BMDMs均不能释放IL-1β，提示该过程严格依赖功能性NLRP3炎症小体；gasdermin D（GSDMD）敲除细胞中白蛋白增强的IL-1β释放降低，表明该过程部分依赖GSDMD。

在"Albumin-enhanced IL-1β release is driven by C. albicans"部分，研究人员发现白蛋白可增强不同来源C. albicans菌株（包括口腔共生株101及阴道分离株C81、CA3153）诱导的IL-1β释放；仅预孵育真菌而非巨噬细胞即可增强炎症反应，提示白蛋白作用于C. albicans；缺失念珠菌溶素编码基因ECE1的突变株（ece1ΔΔ）在白蛋白存在下仍增加IL-1β释放，而白蛋白可中和合成念珠菌溶素诱导的IL-1β释放；筛选发现SAP1缺失突变株（sap1ΔΔ）丧失白蛋白增强的IL-1β释放能力，回补SAP1可恢复该表型；重组Sap1（rSap1）可在LPS预处理的hMDMs中诱导IL-1β释放，且该效应不依赖其蛋白水解活性；rSap1与合成念珠菌溶素协同诱导IL-1β释放；白蛋白可上调SAP1 mRNA表达，特别是在与巨噬细胞相互作用时；体内实验中，sap1ΔΔ感染小鼠在第1周不诱导IL-1β释放及中性粒细胞募集，且与白蛋白水平无显著相关性，而野生型感染小鼠则呈现显著相关性。

在"Albumin promotes fungal fitness during confrontation with macrophages"部分，研究人员发现白蛋白可提高C. albicans（包括WT及sap1ΔΔ）在巨噬细胞内的存活率，但对酵母锁定型efg1ΔΔcph1ΔΔ突变株无此效应；白蛋白延迟早期吞噬但促进后续菌丝内生长；白蛋白可中和H₂O₂对真菌的抑制生长作用，并调控氧化应激基因表达；携带过氧化氢酶1基因（CAT1）启动子-GFP报告菌株的真菌在白蛋白存在下CAT1启动子活性增强；而cat1ΔΔ突变株失去白蛋白增强IL-1β释放的能力，提示白蛋白通过增强真菌氧化应激抗性促进其在巨噬细胞内的存活与SAP1表达。

在"Albumin causes dysfunctional neutrophil activation and fungal clearance"部分，研究人员发现经C. albicans及白蛋白处理的巨噬细胞上清可增强中性粒细胞表面活化标志物CD11b及CD66b的表达；白蛋白损害中性粒细胞限制C. albicans菌outgrowth的能力，即使存在IL-1β亦不能逆转；白蛋白及IL-1β均促进感染期间的中性粒细胞胞外诱捕网（NETosis），但同时损害中性粒细胞来源活性氧（ROS）的产生。

讨论部分指出，VVC的免疫病理具有多因素特征，难以归因于单一因素。本研究证实阴道白蛋白通过双重机制参与VVC发病：一方面，白蛋白作为强效抗氧化剂并诱导真菌氧化应激抗性基因，增强C. albicans在巨噬细胞及中性粒细胞内的存活能力；另一方面，存活真菌上调Sap1表达，后者与菌丝生成及念珠菌溶素协同，显著增强巨噬细胞NLRP3炎症小体激活，驱动IL-1β高炎症反应。同时，白蛋白通过直接抑制ROS并损害中性粒细胞杀菌功能，导致先天免疫细胞对真菌的清除功能障碍。综上所述，阴道局部白蛋白过量通过促进C. albicans的Sap1表达与NLRP3炎症小体激活，导致VVC特征性的高炎症免疫应答与功能障碍性真菌清除，从而构成疾病免疫病理的关键驱动因素。这一发现不仅深化了对RVVC发病机制的理解，也为开发针对宿主-微生物互作界面的治疗策略提供了理论依据。