人眼表组织IgA表达细胞分布及干眼病与原发性干燥综合征患者Schirmer试纸提取物中IgA2丰度降低

《Cells》：IgA-Expressing Cells at the Human Ocular Surface and Reduced Tear IgA2 Abundance in Schirmer Strip Extracts from Patients with Dry Eye Disease and Primary Sj?gren’s Syndrome

　　

该研究考察人眼组织中IgA表达细胞的分布，以及干眼病（dry eye disease, DED）和原发性干燥综合征（primary Sj?gren’s syndrome, pSS）患者Schirmer试纸提取物中的IgA亚类谱。研究人员对遗体捐献者的石蜡包埋泪腺、结膜和角膜组织进行免疫荧光染色（immunofluorescence staining）。另独立分析健康对照（n = 18）、DED患者（n = 75）和pSS患者（n = 10）的Schirmer试纸提取物。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）法测定总蛋白浓度，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量总IgA、IgA₁和IgA₂，并按总蛋白归一化。在泪腺和结膜基质中检测到CD38⁺和CD38^?IgA表达细胞，其中IgA₁表达细胞多于IgA₂表达细胞。所检查的角膜切片中未检测到IgA阳性细胞。pSS患者总蛋白浓度低于DED患者。与对照相比，DED和pSS患者归一化IgA₂丰度均降低，pSS患者归一化总IgA亦降低。未归一化的提取物浓度呈现总体相似的模式。这些独立发现表明回收的IgA亚类谱存在差异，但采集材料和患者特征的差异使这些改变不能完全归因于基础疾病。

研究背景：眼表（ocular surface）由角膜、结膜、眼睑腺体和泪腺组成，泪膜维持眼表稳定并抵御微生物。泪膜稳态破坏可导致干眼病（dry eye disease, DED），全球患病率约5%—50%，表现为眼干、烧灼、刺激和疼痛；DED可分为蒸发型干眼（evaporative dry eye, EDE）、水液缺乏型干眼（aqueous-deficient dry eye, ADDE）和混合型干眼（mixed dry eye, MDE）。DED常伴原发性干燥综合征（primary Sj?gren’s syndrome, pSS），后者以泪腺和唾液腺淋巴细胞浸润及进行性功能障碍为特征。既往认为pSS和眼表炎症主要由T细胞介导，但B细胞及浆细胞的作用受到关注。IgA是泪膜等黏膜分泌物的主要抗体，包括IgA₁和IgA₂；分泌型IgA（secretory IgA, sIgA）可结合并中和病原体、阻止微生物黏附上皮，其中IgA₂可能对中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞具有促炎作用。IgA由泪腺和结膜上皮下浆细胞产生，经聚合免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor, pIgR）转运至黏膜表面。既往已证实人眼组织局部产生IgA并研究过泪腺IgA亚类，但IgA₁/IgA₂生成细胞在眼表相关组织的分布和相对丰度仍不完全清楚，DED和pSS泪液IgA亚类谱资料也较少。泪液IgA变化可能源于产生、分泌、上皮转运、降解或泪液产生改变，单凭含量不能确定机制。因此，该研究一方面系统定位人眼表组织IgA、IgA₁、IgA₂生成细胞，另一方面比较对照、DED和pSS的Schirmer试纸提取物中总IgA及亚类丰度，以补充眼表IgA黏膜免疫及其疾病改变的信息。

研究开展与总体结论：研究人员采用免疫荧光染色（immunofluorescence staining, IF）分析遗体供者泪腺、结膜和角膜组织，并独立采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）法和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）分析Schirmer试纸提取物；结果显示泪腺和结膜下结缔组织存在IgA表达细胞且IgA₁占优，所检查角膜切片未见IgA阳性细胞；DED和pSS患者归一化IgA₂丰度降低，pSS总IgA亦降低。由于组织与泪液样本来自独立个体且供者临床状态未知，研究不能建立组织细胞与泪液IgA差异的直接关系，也不能将差异完全归因于疾病。其意义在于补充人眼表IgA表达细胞分布和DED/pSS泪液IgA亚类改变的独立证据，提示眼表IgA稳态可能发生变化，并为后续研究IgA产生、上皮转运和调控提供线索。

方法概括：组织来自德国FAU（Friedrich-Alexander-Universit?t Erlangen-Nürnberg）解剖学遗体捐献项目，取泪腺、眼睑结膜和角膜，固定、石蜡切片，IF检测CD38与IgA/IgA₁/IgA₂，每供者每组织1张切片、5个随机视野计数。泪液来自FAU和奥地利Graz大学伦理批准队列：对照18例、DED 75例、pSS 10例，Schirmer试纸采集右眼并缓冲液提取，DED按Schirmer type1及睑板腺功能障碍（meibomian gland dysfunction, MGD）分为ADDE、EDE、MDE。BCA法测总蛋白，ELISA测总IgA/IgA₁/IgA₂并按总蛋白归一化；采用组间检验、敏感性分析及探索性分层/相关分析。

研究结果：
3.1 人眼表组织中IgA及IgA亚类阳性细胞的发生与空间分布：IF显示，泪腺结缔组织尤其靠近腺泡处以及结膜下眼睑结缔组织中存在CD38⁺IgA⁺细胞，并可见IgA₁或IgA₂表达；所检查角膜切片未见IgA阳性细胞。每张切片5个随机视野定量显示，泪腺CD38⁺IgA⁺细胞数显著高于眼睑结缔组织。CD38⁺IgA₁⁺细胞在泪腺和眼睑结缔组织中均显著多于CD38⁺IgA₂⁺细胞，IgA₁/IgA₂比值分别为1.2和3.0；眼睑结膜下CD38⁺IgA₂⁺细胞仅少见。研究还检测到CD38^?IgA表达细胞。结论是IgA表达细胞主要位于泪腺和结膜下结缔组织，角膜未检出，且IgA₁表达细胞占优。

3.2 pSS患者Schirmer试纸提取物中总蛋白浓度及IgA丰度降低：BCA法显示pSS患者总蛋白浓度显著低于DED，DED与对照无显著差异；探索性亚型分析中EDE高于pSS。按总蛋白归一化后，pSS总IgA显著低于对照和DED；DED和pSS的IgA₂均显著低于对照；IgA₁及IgA₁/IgA₂比值无显著差异。纳入既往剔除离群值的敏感性分析仍支持对照与DED、对照与pSS的IgA₂差异。未归一化浓度总体模式相似：pSS总IgA和IgA₂低于对照，pSS总IgA、IgA₁、IgA₂低于DED，DED的IgA₂低于对照，但具体比较的显著性不同。亚型分析中pSS归一化总IgA低于MDE，pSS归一化IgA₂低于对照。性别分层仅见女性pSS的IgA₁/IgA₂比值高于女性对照；年龄分层见>50岁pSS总IgA降低、>50岁DED或pSS的IgA₂降低、>50岁DED和pSS的IgA₁/IgA₂比值升高，且pSS无≤50岁患者。相关分析多数仅为名义显著，经Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后仅≤50岁对照的IgA₁/IgA₂比值与眼表疾病指数（Ocular Surface Disease Index, OSDI）及Schirmer试验值呈负相关。总体上，pSS总蛋白和总IgA降低，DED与pSS的IgA₂降低，亚组、性别、年龄和相关分析均为探索性。

讨论部分总结：研究人员认为，泪腺和结膜下IgA表达细胞符合眼相关组织参与局部黏膜免疫；角膜无IgA阳性细胞与角膜需维持透明、免疫反应受严格调控以及眼表免疫监视主要依赖泪液分泌成分相符。IgA₁占优类似血液和呼吸道，肠道IgA₂相对富集可能与微生物暴露及IgA₁蛋白酶有关，但本研究未评估微生物负荷。pSS总蛋白降低可能与自身免疫性炎症导致泪腺分泌功能受损有关，DED异质性较大；但泪液量、采集和提取效率及回收蛋白组成均影响总蛋白，不能仅归因于泪腺功能。归一化可校正回收蛋白量，但总蛋白组间不同；未归一化结果总体相似，离群值敏感性分析支持IgA₂差异，但不证明IgA₂选择性受损。年龄和性别分层均为探索性，IgA₁/IgA₂比值升高可能只是IgA₂相对下降，比值在低分母时不稳定；FDR校正后仅≤50岁对照的比值与OSDI及Schirmer值呈负相关，不能推断因果。研究人员提出IgA表达细胞数量/分化/存活/分泌、pIgR转运、上皮屏障和血管通透性、血清来源IgA、IgA稳定性及FcαRI相互作用等假设，但局限包括组织与泪液为独立队列、供者临床状态未知、取材范围有限、对照与患者Schirmer试纸厂家不同、提取效率和泪液量影响、未区分分泌型与血清来源IgA、年龄性别及用药混杂，pSS样本仅10例。

研究结论（翻译）：本研究在人泪腺和结膜组织中发现IgA表达细胞，且IgA₁表达细胞多于IgA₂表达细胞。独立分析显示，与健康对照相比，DED和pSS患者Schirmer试纸提取物中归一化IgA₂丰度降低。这些发现为眼表IgA稳态提供了互补信息，但未建立组织IgA表达细胞群与Schirmer试纸提取物中IgA差异之间的直接关系。采集材料、蛋白回收和患者特征的差异使这些发现不能完全归因于基础疾病。仍需采用标准化采集程序和匹配良好的临床队列进一步明确这些观察的生物学意义及潜在机制。