《Cells》：A Novel NKAP Gene Frameshift Mutation in a Sardinian Family Causes Early Cell Death and Secondary Skewed X-Chromosome Inactivation and Associates with Multiple Male Miscarriages
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NF-κB激活蛋白（NKAP）基因定位于Xq24，编码一种参与NF-κB转录因子激活的核蛋白。既往研究报道，NKAP基因错义变异与男性X连锁智力障碍相关。本研究通过靶向X染色体测序（X-TRS），在一个撒丁岛家系的7名女性中鉴定出一个复发的全新移码变异c.17
NF-κB激活蛋白（NKAP）基因定位于Xq24，编码一种参与NF-κB转录因子激活的核蛋白。既往研究报道，NKAP基因错义变异与男性X连锁智力障碍相关。本研究通过靶向X染色体测序（X-TRS），在一个撒丁岛家系的7名女性中鉴定出一个复发的全新移码变异c.172del（p.His58Ilefs74*），这些女性均表现为完全偏斜的X染色体失活（XCI）。为探究该突变的功能效应，研究人员分别在健康供体成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞中敲除（KO）和敲低（KD）NKAP基因，并对先证者来源的成纤维细胞进行了RNA测序、免疫荧光和蛋白质印迹分析。研究证明，NKAP移码变异导致单等位基因野生型（WT）转录，且不直接影响XCI，提示其为继发性而非原发性XCI偏斜。经基因编辑的NKAP人成纤维细胞发生细胞死亡，导致WT细胞被正向选择。NKAP蛋白正确定位于细胞核，但表达水平降低。研究还证实，XIST表达不受该NKAP突变影响，进一步排除了原发性XCI事件的可能。研究结果表明，这一新型NKAP移码变异导致早期细胞死亡和突变细胞的有丝分裂后负向选择，从而形成完全继发性XCI。女性携带者健康且有生育能力，而受累男性可能无法存活。总之，该研究结果为理解NKAP在细胞中的作用以及人类生育力相关的全新临床意义提供了重要见解。
NKAP基因新移码突变：从继发性X染色体失活到男性反复流产的机制解析
一、研究背景与科学问题
NF-κB激活蛋白（NKAP）由位于Xq24的NKAP基因编码，是一种高度保守的核蛋白，参与转录抑制、T细胞发育与成熟、成体造血干细胞维持与存活、细胞增殖以及RNA剪接与加工等多种关键生物学过程。既往研究显示，NKAP基因的错义突变（如p.Arg330Cys、p.Arg330His、p.Arg333Gln、p.Ile337Thr和p.Arg361Gln）可导致Hackmann–Di Donato综合征（HDD），表现为马凡样特征、智力障碍、发育迟滞及骨骼肌肉异常。然而，NKAP基因功能丧失型变异在人类中的表型后果尚不明确。
在雌性哺乳动物中，X染色体失活（XCI）是随机发生的发育事件，通常产生50:50至≤90:10的等位基因表达比例。当这一比例显著偏离平衡时，即称为偏斜XCI。偏斜XCI可分为原发性和继发性两类：原发性偏斜源于X失活中心（XIC）调控的随机选择偏差；继发性偏斜则并非随机事件，而是由细胞群体中的正向或负向选择所致——携带突变X染色体活跃的细胞因生存劣势而被清除，最终富集表达正常X染色体的细胞群体，从而模拟完全偏斜的XCI模式。
本研究针对一个撒丁岛家系展开。该家系中7名女性携带NKAP基因外显子1的新型移码变异c.172del（p.His58Ilefs74*），均表现为完全偏斜XCI（100:0），且家系中反复出现男性流产，7名杂合女性携带者未生育任何男性后代。这一独特家系为阐明NKAP功能丧失变异的致病机制及其与XCI偏斜和男性流产的关联提供了理想的研究对象。
二、研究设计与主要结论
研究人员通过靶向X染色体测序（X-TRS）在该家系中鉴定出NKAP基因c.172del（p.His58Ilefs74*）移码变异，该变异在gnomAD v4.1数据库中频率为0，预测导致下游多个提前终止密码子，依据ACMG标准被归类为可能致病。Sanger测序在7名女性中验证了该变异的存在，并确认其母源遗传。HUMARA分析证实，先证者III4的外周血淋巴细胞和皮肤成纤维细胞均表现为完全偏斜XCI，且成纤维细胞cDNA仅检测到野生型（WT）NKAP转录本，证实突变等位基因已被完全灭活。
功能研究方面，研究人员在健康供体成纤维细胞中通过CRISPR/Cas9系统敲除NKAP基因，观察到NKAP敲除细胞凋亡率显著升高（21天时Annexin V阳性细胞达16.4%，对照组为7.78%），且40天后培养上清中漂浮的死亡细胞约80%为NKAP敲除细胞，而贴壁存活细胞中敲除效率从45.7%降至30.5%，表明NKAP缺失导致细胞负向选择，WT细胞被正向富集。在小鼠胚胎干细胞中，研究人员通过siRNA介导的Nkap敲低实验证实，Nkap缺失不影响Xist介导的基因沉默——在未分化条件下，Nkap敲低组与对照组的GFP报告基因沉默效率相当（86.7–87.5% vs 89.3–89.5%），分化条件下敲低组沉默效率甚至略有增强（27.3–29.6% vs 33.3–40.6%），进一步排除了NKAP在原发性XCI中的直接作用。
三、关键技术方法
研究采用的主要技术方法包括：靶向X染色体测序（X-TRS）对11名家系成员进行变异筛查；HUMARA分析评估XCI模式；CRISPR/Cas9基因编辑在健康供体成纤维细胞中敲除NKAP基因；siRNA介导的基因敲低在小鼠胚胎干细胞中降低Nkap表达；RNA测序（RNA-seq）分析先证者成纤维细胞的转录组变化；免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）检测NKAP蛋白的定位与表达水平；流式细胞术（Annexin V凋亡检测）评估细胞凋亡。样本来源包括撒丁岛家系11名成员的外周血样本、先证者III4的皮肤成纤维细胞，以及3株健康女性皮肤成纤维细胞对照系。
四、研究结果
X-TRS鉴定出NKAP基因新型移码突变： 对11名家系成员的X-TRS分析（平均深度440×）经变异过滤和共分离分析，鉴定出NKAP基因c.172delC（p.His58Ilefs74*）移码变异，与7名杂合女性的偏斜XCI模式共分离。该变异在gnomAD v4.1中频率为0，预测导致功能丧失，依据ACMG标准分类为可能致病。
HUMARA分析证实突变成纤维细胞中完全偏斜XCI： 先证者III4的皮肤成纤维细胞经HUMARA分析确认呈完全偏斜XCI（100:0），与外周血淋巴细胞结果一致，证实偏斜XCI存在于两个独立组织中。Sanger测序进一步证实成纤维细胞cDNA仅表达WT NKAP转录本，突变mRNA缺失。
RNA分析显示NKAP降低伴随XIST轻度上调： RT-qPCR分析显示，先证者III4成纤维细胞中NKAP表达轻度降低（0.86 2?ΔΔCt），XIST表达轻度升高（1.46 2?ΔΔCt），NKAP/XIST比值较对照组降低（0.24 vs 0.41），提示NKAP减少与XIST上调存在关联。
RNA-seq揭示广泛的转录失调： 先证者成纤维细胞RNA-seq分析鉴定出1266个差异表达基因（DEGs），其中744个上调、522个下调。基因本体（GO）分析显示主要涉及细胞过程、生物调控、代谢过程等；KEGG通路分析提示PI3K-Akt信号通路、内吞作用和黏着斑等细胞通讯相关通路富集，与既往HDD综合征患者细胞中的转录失调模式相似。
NKAP定位于突变成纤维细胞核内： 免疫荧光分析显示WT-NKAP蛋白正确定位于细胞核，信号强度与对照组无明显差异；蛋白质印迹定量分析显示先证者III4成纤维细胞中NKAP蛋白水平较对照组显著降低21%。
NKAP敲除导致原代成纤维细胞死亡增加： CRISPR/Cas9介导的NKAP敲除实验显示，NKAP敲除成纤维细胞凋亡率显著升高，且死亡细胞中NKAP敲除比例高达约80%，而存活细胞中敲除效率下降，证实NKAP缺失导致细胞负向选择。
Nkap敲低不损害Xist介导的GFP报告基因沉默： 在可诱导Xist的小鼠胚胎干细胞系中，Nkap敲低（转录水平降至对照的9–12%）不影响Xist介导的GFP沉默效率，分化条件下甚至轻度增强沉默效果，证明NKAP在Xist介导的基因沉默中并非必需。
五、讨论与结论
研究讨论指出，NKAP基因外显子1移码变异与既往报道的HDD综合征错义突变（集中于外显子8和9，编码HDAC3/转录抑制结构域）在表型和机制上均存在本质差异。本家系中无存活男性患者，结合反复男性流产的发生，提示该变异导致X连锁显性、等位基因特异的细胞致死性。NKAP在细胞分裂中的关键作用——通过锚定CENP-E至着丝粒参与染色体排列——为解释突变细胞早期死亡提供了机制基础：NKAP缺失导致染色体错位、前中期增殖阻滞和基因组不稳定，最终引发细胞凋亡。因此，本家系中观察到的完全偏斜XCI并非原发性XCI缺陷，而是突变细胞在发育过程中被负向选择、WT细胞被正向富集的继发性结果。研究还证实NKAP敲低不影响Xist介导的基因沉默，进一步排除了其在原发性XCI中的直接作用。RNA-seq数据揭示的转录失调主要涉及信号转导和癌症相关通路，与NKAP在细胞增殖和信号通路中的已知功能一致。
结论部分指出，本研究描述了一种NKAP基因外显子1的新型移码突变，该突变不导致已知的HDD综合征表型。通过功能实验和RNA分析，研究证明NKAP敲低不影响XIST介导的基因沉默，而NKAP编辑的人成纤维细胞发生早期细胞死亡，提示该基因在人类表型——尤其是不孕和反复流产——中发挥新的作用。NKAP通过其外显子1编码的N端精氨酸/丝氨酸富集结构域，介导与RNA结合蛋白、剪接因子和核斑点的相互作用，可能通过平衡细胞存活与凋亡、作为转录抑制因子和染色质修饰因子、并在有丝分裂染色体排列中发挥关键作用来调控细胞死亡倾向。因此，在临床评估不孕、反复流产及其他生育相关疾病时，筛查NKAP基因突变具有重要价值。
