《Foods》：Development of Candied Strawberry Products via Neural Network-Optimized Sugar-Infiltration Processes
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向清洁标签（clean label）和植物基食品的转变，加剧了对天然发酵策略的需求，以减少不良风味，同时改善植物蛋白的风味和营养品质。本研究评估了从动物源成熟食品中分离的142株微生物，筛选出4株具有蛋白水解活性的革兰氏阳性球菌（Staphylococcus
向清洁标签（clean label）和植物基食品的转变，加剧了对天然发酵策略的需求，以减少不良风味，同时改善植物蛋白的风味和营养品质。本研究评估了从动物源成熟食品中分离的142株微生物，筛选出4株具有蛋白水解活性的革兰氏阳性球菌（Staphylococcus warneri GC 13和GC 28、Rothia uropygioeca GC 15以及Enterococcus lactis GC 40），用于发酵豌豆分离蛋白（pea protein isolate）和组织化豌豆蛋白（textured pea protein）作为植物基模型底物。在25 °C下发酵48 h，显著改变了微生物学和理化参数，且呈现基质依赖性，其中组织化豌豆蛋白较豌豆分离蛋白支持更高的乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）生长和更强的酸化作用。游离氨基酸（free amino acids, FAA）谱分析表明蛋白水解活性具有菌株和基质依赖性，GC 13和GC 15在豌豆分离蛋白中促进了最高的总游离氨基酸含量，而GC 15、GC 28和GC 40在组织化豌豆蛋白中显著增加了多种氨基酸。生物胺（biogenic amines）分析显示，酪胺（tyramine）为主要胺类，在接种的组织化豌豆蛋白中达到162–212 ng/g，在未接种对照中为348 ng/g，而在豌豆分离蛋白中仅检测到痕量水平。挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）分析将化合物分为三类，证明天然豆腥味醛类减少，并形成了醇类、酮类和酸类，尤其在组织化蛋白中更为明显，表明香气特征发生了实质性重塑。总体而言，研究结果表明，所评估的菌株可作为清洁标签工具，增强蛋白水解、减弱不良风味，并在豌豆蛋白基质中维持可接受的生物胺水平，其中R. uropygioeca GC 15作为植物蛋白发酵的有前景候选菌株脱颖而出。
论文解读
一、研究背景与意义
全球食品工业正经历深刻变革，消费者对清洁标签产品的需求持续上升，要求食品生产更加透明、加工过程最小化且不含合成添加剂。在此背景下，植物基蛋白作为动物蛋白的可持续替代品受到广泛关注，但其推广面临显著感官障碍，尤其是豆腥味和苦味等不良风味严重制约消费者接受度。这些特征风味主要来源于脂质氧化产物，包括醛类和酮类化合物。传统风味改善方法往往依赖掩蔽剂或合成风味增强剂，这与清洁标签生产原则相悖。微生物发酵作为一种天然生物技术手段，可在不添加人工添加剂的情况下改善植物基产品风味，同时提升营养价值和感官品质。然而，目前对菌株特异性蛋白水解谱系的系统认识、发酵参数优化以及风味化合物形成机制的阐明仍不充分，且多数蛋白水解活性研究在无菌植物基质中进行，未涉及含有污染微生物群的真实非灭菌基质。因此，本研究旨在探索将筛选的蛋白水解微生物应用于非灭菌植物基基质，作为清洁标签策略实现天然风味开发，同时提升营养价值和感官品质。
二、研究内容与主要结论
研究人员从埃斯特雷马杜拉大学食品卫生与安全研究组菌株库中选取142株来源于动物源成熟制品的微生物，通过蛋白水解和脂解活性筛选，获得4株具有蛋白水解活性且低或无脂解活性的革兰氏阳性球菌，经全基因组测序（whole genomic sequencing, WGS）鉴定为Staphylococcus warneri（GC 13和GC 28）、Rothia uropygioeca（GC 15）和Enterococcus lactis（GC 40）。研究人员将这4株菌分别接种于豌豆分离蛋白和组织化豌豆蛋白两种基质中，在25 °C下发酵48 h，系统评估了发酵过程中的微生物学、理化、游离氨基酸、生物胺和挥发性化合物变化。研究结果表明，发酵显著改变了两种蛋白基质的理化参数和微生物群落，组织化豌豆蛋白较豌豆分离蛋白表现出更强烈的酸化和更高的乳酸菌生长；游离氨基酸积累呈菌株和基质依赖性，GC 13和GC 15在豌豆分离蛋白中促进最高总游离氨基酸，而GC 15、GC 28和GC 40在组织化蛋白中显著增加多种氨基酸；生物胺分析显示酪胺为主要胺类，但含量远低于EFSA安全阈值；挥发性化合物分析表明发酵有效降解了天然豆腥味醛类并形成了醇类、酮类和酸类等新风味化合物。该研究的重要意义在于证明了筛选菌株可作为清洁标签工具应用于非灭菌植物蛋白基质，在增强蛋白水解、减弱不良风味的同时维持可接受的生物胺水平，为植物蛋白发酵的工业化应用提供了菌株筛选和工艺优化的科学依据。
三、关键技术与方法
研究人员采用了多项关键技术方法。首先，通过蛋白水解琼脂和脂解琼脂平板法对142株微生物进行酶活性筛选；其次，利用全基因组测序技术对筛选菌株进行物种鉴定，采用Oxford Nanopore MinION平台测序，经Dorado碱基识别、Filtlong质量过滤、Porechop_ABI接头去除后，通过Hybracter工作流程进行de novo基因组组装，并使用GTDB-Tk和FastANI进行分类学确认；再次，以豌豆分离蛋白和组织化豌豆蛋白为发酵底物，在25 °C下进行48 h发酵实验，设置未接种对照，每组三次重复；此外，采用高效液相色谱-高分辨质谱联用（HPLC-HRMS）技术测定游离氨基酸和生物胺，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）技术分析挥发性化合物；最后，运用Shapiro–Wilk检验、Levene检验、Tukey's HSD、Kruskal–Wallis H或Dunnett's T3等统计方法进行数据分析，并使用RStudio进行挥发性化合物的层次聚类热图可视化。
四、研究结果
4.1 微生物筛选
在142株微生物中，仅GC 13、GC 15、GC 28和GC 40四株革兰氏阳性球菌在72 h内表现出确认的蛋白水解活性，其中GC 13和GC 28在48 h形成水解圈，GC 15和GC 40在72 h形成。GC 13和GC 28还表现出低脂解活性，其余菌株在7天孵育期内未显示脂解活性。
4.2 菌株鉴定
经全基因组测序鉴定，GC 13和GC 28为Staphylococcus warneri，GC 15为Rothia uropygioeca，GC 40为Enterococcus lactis。初步基因组分析显示这些菌株不含主要抗生素耐药基因（包括vanA/vanB）和主要毒力基因（包括esp、hyl、asa1、gelE和cylA）。
4.3 理化与微生物学分析
在豌豆分离蛋白中，接种菌株导致pH从初始7.15逐渐降至第2天的6.37–6.55；在组织化豌豆蛋白中酸化更为显著，pH从7.08降至5.22–5.41。水分活度（aw）在整个发酵期间维持在约0.980，无显著差异。微生物计数方面，豌豆分离蛋白中GC 15和GC 40在MSA上达到最高浓度约8.0 log CFU/g，组织化豌豆蛋白中两者同样达到约8.5 log CFU/g。乳酸菌在豌豆分离蛋白中第2天才检测到（3.35–4.56 log CFU/g），而在组织化蛋白中第1天即达6.30–8.30 log CFU/g。组织化豌豆蛋白整体支持更高的微生物计数，尤其是需氧嗜中温和乳酸菌。
4.4 游离氨基酸
豌豆分离蛋白初始游离氨基酸浓度较低，主要检测到Tyr（4.07 μg/g）、Ile/Leu（0.78 μg/g）等。发酵后，GC 13和GC 15显著促进多种游离氨基酸增加，GC 13发酵样品总游离氨基酸达60.90 μg/g。组织化豌豆蛋白初始游离氨基酸谱更为多样且含量更高，GC 15、GC 28和GC 40在第2天显著促进多种氨基酸积累。总体而言，组织化蛋白中Glu、Val、Ile/Leu、Lys、Gln和总游离氨基酸含量显著高于豌豆分离蛋白，而Tyr在豌豆分离蛋白中含量更高。
4.5 生物胺
豌豆分离蛋白中仅检测到酪胺和色胺，总生物胺含量始终低于1.2 ng/g。组织化豌豆蛋白中酪胺为主要胺类，第2天接种样品达162–212 ng/g，未接种对照达348 ng/g。GC 28和GC 40接种批次及未接种对照的总生物胺较基线显著增加。组织化基质中总生物胺含量在第2天显著高于豌豆分离蛋白。
4.6 挥发性化合物
挥发性化合物分为三个聚类：聚类1为原料中天然存在的醛类（戊醛、己醛、庚醛、苯甲醛、2-辛烯醛、壬醛等）和酮类，发酵后显著降低，如豌豆分离蛋白中己醛从约21.7×106 AU降至接种批次<1×106 AU；聚类2为发酵过程中产生的支链醛类、高级醇类（1-戊醇、1-己醇等）、烃类和酚类，在豌豆分离蛋白中积累更明显；聚类3为组织化蛋白中特异形成或显著增强的短链酸类和含氧酮类，包括乙酸、3-甲基-1-丁醇、2,3-丁二酮和3-羟基丁酮等，这些化合物在豌豆分离蛋白中未检测到。
五、讨论与结论
讨论部分指出，菌株筛选和发酵驱动的代谢谱分析表明，受控微生物发酵可作为清洁标签策略，同时解决植物蛋白的风味改善和营养局限性问题。菌株依赖性游离氨基酸生成增强了蛋白品质和生物利用度，同时降解了天然不良风味醛类。基质依赖性差异揭示了蛋白加工历史决定发酵结果，强调了针对特定基质优化发酵菌种和参数的必要性。从实际生物技术角度看，R. uropygioeca GC 15在游离氨基酸积累、挥发性风味谱和微生物生长动力学方面表现优异，同时维持了可接受的生物胺安全水平。研究结论为：筛选的4株蛋白水解菌株（S. warneri GC 13、GC 28，R. uropygioeca GC 15和E. lactis GC 40）证明受控微生物发酵可提供清洁标签方法，改善植物蛋白风味和营养限制，同时控制生物胺产生。研究证明筛选菌株可成功应用于非灭菌植物蛋白底物，支持开发可能减少或避免蛋白原料预先灭菌需求的发酵工艺，同时保持工艺安全性。在提出工业化应用之前，仍需通过全基因组测序进一步分析以确保4株筛选菌株的安全性。
