分子动力学指导的柔性区二硫键工程协同提升脂肪酶ATL热稳定性与催化性能

《Foods》：Improving the Thermostability of Lipase ATL by Engineering Disulfide Bonds in Flexible Regions

　　

脂肪酶是合成功能性脂质的多功能生物催化剂，但其工业应用常受限于有限的热稳定性。本研究采用靶向柔性区域的二硫键工程提高塔玛曲霉（Aspergillus tamarii）来源脂肪酶ATL的热稳定性，该柔性区域由分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟识别。携带二硫键A46C-N68C和L263C-G271C的组合突变体Mut2D，与野生型ATL相比，熔解温度（T_m）提高5.83 °C，45 °C下半衰期延长23.9倍。Mut2D对对硝基苯酚丁酸酯（pNP-butyrate）、对硝基苯酚癸酸酯（pNP-caprate）和对硝基苯酚硬脂酸酯（pNP-stearate）的催化效率（k_cat/K_m）较野生型分别提高34.7%、27.0%和39.0%。比较MD模拟显示，引入这两个二硫键增加了酶的整体构象刚性，这很可能解释其热稳定性提高。在二酰甘油（diacylglycerol，DAG）合成中，Mut2D在各自最适温度下较野生型获得高4.8%的DAG含量且反应速率更快。该研究为ATL的工业应用铺平道路，并为提高其他脂肪酶的热稳定性提供有价值见解。

功能性脂质在食品与健康领域受到关注，二酰甘油（diacylglycerol，DAG）、富含omega-3脂质和人乳脂替代物等可通过改造分子组成与结构改善理化及生物学性质。脂肪酶可催化水解、酯化、转酯和酸解，具有底物、区域和立体选择性，是功能性脂质合成的关键生物催化剂；与化学法相比，酶法具有条件温和、环境友好和产物纯度高等优势。热稳定性是评价酶工业应用的重要参数，高热稳定性可提高高温下动力学与操作稳定性、加快反应、降低微生物污染风险、便于生物催化剂回收并降低制造成本。然而天然酶常热稳定性不足。传统定向进化依赖大规模突变库和高通量筛选，计算理性设计可快速识别有利突变；MD模拟可用于识别蛋白质构象柔性区，并通过引入氢键、π-π相互作用、盐桥和二硫键等稳定相互作用限制柔性区。二硫键（disulfide bond，由两个半胱氨酸残基的硫醇基形成的共价连接）可降低展开态构象熵、减缓去折叠并阻碍变性。ATL具有高区域选择性，但热稳定性有限，因此研究人员在ATL柔性区开展二硫键工程，筛选有益单二硫键并组合，结合同源建模与MD模拟阐明机制，并评估突变体在DAG制备中的催化效果；该研究为ATL工业应用及其他脂肪酶热稳定性改造提供参考。

关键技术方法概括：样本来源为GenBank登录号EU131679的ATL基因和PDB ID 5XK2的晶体结构。采用GROMACS 2024.5在AMBER ff14SB力场下于473 K进行100 ns MD模拟，以C_α原子均方根涨落（root-mean-square fluctuation，RMSF）识别柔性区；用DbD2、SSBOND和BridgeD预测二硫键候选；定点突变构建突变体，在P. pastoris X33中表达并经Ni-NTA纯化；以差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry，DSF）测定T_m，测定最适温度、pH、动力学参数及45 °C半衰期（t_1/2）；用Ellman法检测游离硫醇；用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）分析DAG合成；用SPSS 26.0统计。

3.1 柔性区域识别与二硫键设计（Flexible Region Identification and Disulfide Bond Design）：通过473 K MD模拟计算C_α原子RMSF，发现多个残基峰RMSF超过0.6 nm，包括N端及25、65、86、120、252和277位；DbD2、SSBOND和BridgeD预测并选择10个候选二硫键突变体。结论是这些高柔性区域可作为二硫键引入的重点，但需满足几何条件。

3.2 野生型ATL与二硫键突变体的表达纯化（Expression and Purification of Wild-Type ATL and Disulfide Bond Mutants）：通过异源表达、Ni-NTA亲和纯化及SDS–PAGE分析，所有样品呈单一目标条带，纯度满足后续生物物理表征。

3.3 稳定化二硫键鉴定（Identification of Stabilizing Disulfide Bonds）：通过DSF测定T_m，10个突变体中4个ΔT_m>1.0 °C；A46C-N68C最高，较野生型提高4.09 °C，S84C-A92C、A249C-Q259C和L263C-G271C分别提高1.51、2.31和2.16 °C；45 °C下t_1/2分别延长约4.5、8.5、6.9和10.9倍；A46C-N68C的T_opt升至50 °C；Ellman法显示游离硫醇较低，支持二硫键形成。D251C-W290C、G265C-N268C和F269C-G274C使T_m下降2.94—4.15 °C，说明二硫键工程需综合考虑。

3.4 稳定二硫键组合（The Combination of Stabilizing Disulfide Bonds）：通过将A46C-N68C与L263C-G271C组合构建Mut2D（A249C-Q259C因表达低未组合）；Ellman法显示游离硫醇为0.033 mol/mol；Mut2D的T_m为56.51 °C，较野生型高5.83 °C，较两个单突变分别高1.74和3.67 °C；45 °C下t_1/2达685.3 min，较野生型长23.9倍，显示协同作用。Mut2D的T_opt为50 °C，pH_opt仍为6.0；pH 3、pH 9和pH 10残余活性较野生型分别高12.4%、12.2%和16.3%。动力学显示Mut2D对pNP-butyrate、pNP-caprate和pNP-stearate的k_cat/K_m分别提高34.7%、27.0%和39.0%，表明热稳定性与催化性能同时提升。

3.5 Mut2D的MD模拟分析（MD Simulation Analysis of Mut2D）：通过473 K、100 ns比较MD模拟，Mut2D的均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）保持低于0.6 nm，野生型升至0.5—0.9 nm；Mut2D的回转半径（radius of gyration，R_g）稳定在1.78—1.82 nm，野生型最大约2.0 nm；疏水溶剂可及表面积（solvent-accessible surface area，SASA）约78对86 nm²/residue；氢键数约190对170；天然接触分数（native contact fraction，Q）为66.3%对44.8%。结论是双二硫键限制整体柔性、保持紧凑折叠和天然接触，延缓疏水暴露与不可逆变性。

3.6 DAG制备（Preparation of DAG）：通过不同温度下酶法酯化及HPLC分析，野生型最适45 °C，10 h平衡DAG含量41.8%；Mut2D最适50 °C，8 h平衡DAG含量46.6%，高4.8%；45 °C下2 h和4 h时Mut2D的DAG含量分别为19.3%和31.6%，高于野生型的15.4%和26.6%，平均DAG生产力显著更高。结论是Mut2D在DAG合成中反应更快且含量更高，具工业应用潜力。

讨论部分指出，二硫键共价交联断裂热力学不利，可限制相关区域移动并降低展开态构象熵；但额外二硫键并非普遍有益，可能破坏既有有利相互作用、形成不利接触或内部空腔、破坏盐桥及异常暴露疏水残基。多二硫键可能降低表达，组合需兼顾。pH稳定性提高与对其他变性因素耐受性相关。MD结果支持二硫键通过限制外周链扩张、维持氢键和天然接触、延迟疏水斑块暴露，从而减少不可逆失活。研究结论译为：研究人员将二硫键工程引入脂肪酶ATL的柔性区域以提高其热稳定性。携带两个额外二硫键的组合突变体Mut2D在热稳定性和催化性能方面同时得到改善。引入的交联增加了酶的整体构象刚性。此外，在DAG制备中，与野生型ATL组相比，突变体Mut2D组表现出更快的反应速率和更高的DAG含量，表明其有潜力进一步开发为固定化生物催化剂用于工业过程中的功能性脂质合成。此外，该研究可能为其他脂肪酶超家族成员的分子工程提供有价值的参考。