山柰酚与N-乙酰半胱氨酸联合应用对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激的协同抗氧化效应研究

《Foods》：Combined Antioxidant Effects of Kaempferol and N-Acetylcysteine on H2O2-Induced Oxidative Stress in SH-SY5Y Cells

　　

摘要专业翻译 本研究探讨了山柰酚（KAE）与N-乙酰半胱氨酸（NAC）联合应用对过氧化氢（H2O2）诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的协同抗氧化效应。研究人员采用联合指数（CI）分析与SynergyFinder评估联合效应，检测了细胞活力、5-(and-6)-氯甲基-2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H2DCFDA）荧光、丙二醛（MDA）、抗氧化酶活性、谷胱甘肽状态以及去乙酰化酶3（SIRT3）、叉头框蛋白O3（FOXO3a）和超氧化物歧化酶2（SOD2）的蛋白表达水平。此外，通过分子对接预测了KAE和NAC与SIRT3的潜在相互作用。CI分析定义的最强协同效应出现在16 μM KAE与2 mM NAC联合时（CI = 0.10），而SynergyFinder的结果因参考模型不同而有所差异。与单独处理相比，联合处理（KNAC）增强了细胞活力，降低了CM-H2DCFDA荧光和MDA水平，改善了抗氧化酶活性和谷胱甘肽氧化还原平衡，并提高了SIRT3、FOXO3a和SOD2的蛋白水平。分子对接预测KAE对SIRT3的结合得分优于NAC。这些发现提示，KAE和NAC可能通过潜在不同的机制产生互补的抗氧化和细胞保护效应，其中KAE可能参与调控与线粒体抗氧化防御相关蛋白的变化，而NAC则支持谷胱甘肽依赖的细胞氧化还原稳态。然而，SIRT3/FOXO3a/SOD2通路的因果参与以及与SIRT3的直接相互作用仍有待实验证实。这些初步发现支持进一步研究将食物来源的KAE与作为谷胱甘肽前体的NAC联合应用以增强细胞抗氧化防御的可行性。

论文解读文章

一、研究背景与目的

氧化应激是活性氧（ROS）产生超过细胞抗氧化防御能力时发生的病理过程，与多种神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的发病机制密切相关。大脑因代谢活性高、耗氧量大、多不饱和脂肪酸含量丰富而抗氧化能力相对有限，对氧化损伤尤为敏感。过量的ROS可促进脂质过氧化、蛋白质和DNA损伤、线粒体功能障碍以及细胞氧化还原稳态的破坏，最终危及神经元存活。因此，维持内源性抗氧化防御和细胞氧化还原平衡被视为限制氧化应激相关神经元损伤的潜在策略。

山柰酚（KAE）是一种天然黄酮醇，广泛存在于水果、蔬菜和茶叶中，具有抗氧化、抗炎和细胞保护活性。其抗氧化作用不仅限于直接清除活性物种，还可影响细胞抗氧化系统和参与氧化还原稳态维持的通路，其中线粒体NAD⁺依赖性去乙酰化酶SIRT3及其下游的FOXO3a和线粒体SOD2构成的信号轴备受关注。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是L-半胱氨酸的含硫醇衍生物，是细胞内谷胱甘肽（GSH）合成的既定前体，其抗氧化活性主要通过增加细胞内半胱氨酸可用性、支持GSH合成和细胞硫醇氧化还原稳态来实现。两种化合物可能作用于抗氧化防御网络的不同层面，但二者在不同浓度组合下是否存在协同交互及其潜在机制尚未明确。本研究旨在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞H₂O₂氧化应激模型中，系统评估KAE与NAC联合应用的抗氧化和细胞保护效应。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用MTT还原法测定细胞活力，通过5×5浓度矩阵（KAE浓度2–32 μM，NAC浓度0.25–4 mM）共25种组合评估联合效应，运用Chou–Talalay联合指数（CI）法和SynergyFinder四种参考模型（Bliss独立模型、Loewe可加性模型、最高单药（HSA）模型和零相互作用效力（ZIP）模型）分析药物交互作用。采用CM-H₂DCFDA荧光探针检测细胞内氧化敏感信号，硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法测定MDA水平，分别测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，使用商品化试剂盒定量总谷胱甘肽、GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG），Western blot检测SIRT3、FOXO3a和SOD2蛋白表达，并利用AutoDock Vina 1.2.0对KAE和NAC与人SIRT3晶体结构（PDB ID: 3GLS）进行分子对接模拟。细胞系为SH-SY5Y（ATCC CRL-2266），使用传代18–20代细胞。

三、研究结果

3.1 KAE和NAC的细胞毒性：KAE在32 μM及以下浓度不影响细胞活力，64 μM及以上显著降低活力；NAC在4 mM及以下无细胞毒性，8 mM及以上显著降低活力。据此确定32 μM KAE和4 mM NAC为最高非细胞毒性浓度。

3.2 KAE和NAC的联合效应：25种组合的归一化细胞活力范围为14.46%–97.78%，16 μM KAE联合2 mM NAC恢复效果最佳。CI分析显示，低NAC浓度（0.25–1 mM）组合主要呈拮抗作用（CI 1.36–1.85），含2–4 mM NAC的组合呈加和至协同作用（CI 0.10–0.97），最强协同为16 μM KAE + 2 mM NAC（CI = 0.10），对应KAE:NAC摩尔比1:125。

3.3 KAE和NAC的协同分析：四种参考模型均显示正平均协同分数（ZIP 0.91、Bliss 1.26、Loewe 2.45、HSA 10.32），但仅Loewe（p = 0.0338）和HSA（p = 1.18 × 10^?6）模型达到统计学显著，ZIP和Bliss模型未达显著，表明协同证据依赖参考模型。

3.4 KNAC对H₂O₂诱导细胞毒性的保护作用：H₂O₂显著降低细胞活力，KAE、NAC和KNAC均显著改善活力，KNAC效果显著优于任一单独处理。

3.5 KNAC对氧化应激的影响：H₂O₂显著增加CM-H₂DCFDA荧光和MDA水平，三种处理均显著降低两项指标，KNAC降低幅度显著大于单独处理。

3.6 KNAC对抗氧化酶活性的影响：H₂O₂显著降低SOD和CAT活性。KAE和KNAC显著恢复SOD活性，NAC单独无显著效果；仅KNAC显著恢复CAT活性；三种处理均显著恢复GSH-Px活性，但KNAC与单独处理差异未达显著。

3.7 KNAC对SIRT3表达的影响：H₂O₂显著降低SIRT3表达，KAE和KNAC显著恢复，NAC单独无显著效果，KNAC显著高于任一单独处理。

3.8 KNAC对FOXO3a和SOD2表达的影响：H₂O₂显著降低FOXO3a和SOD2表达，KAE和KNAC均显著恢复两项表达，NAC单独无显著效果，KNAC显著高于NAC组。

3.9 KNAC对谷胱甘肽氧化还原状态的影响：H₂O₂显著降低总谷胱甘肽和GSH、升高GSSG、降低GSH/GSSG比值。NAC和KNAC显著恢复总谷胱甘肽和GSH，KAE单独无显著效果；三种处理均显著降低GSSG；KNAC的GSH/GSSG比值显著高于KAE和NAC单独处理。

3.10 KAE和NAC与SIRT3的分子相互作用：分子对接显示KAE的Vina评分为?8.2 kcal/mol，与SIRT3的Pro155、Phe180、Leu199、Asn229、Ile230和His248残基形成氢键及芳香/疏水相互作用；NAC的Vina评分为?4.3 kcal/mol，仅与Ile230和Asp231形成氢键。KAE预测结合亲和力优于NAC。

四、讨论总结与结论

研究结果表明，KAE和NAC的交互作用具有浓度依赖性，最强协同出现在16 μM KAE + 2 mM NAC组合。KAE主要贡献于蛋白调控层面，特别是SIRT3/FOXO3a/SOD2轴的恢复，而NAC主要通过补充半胱氨酸支持GSH合成。KNAC同时调动酶调控和底物依赖的抗氧化防御机制，产生优于任一单独处理的细胞保护效应。分子对接预测KAE与SIRT3结合亲和力优于NAC，提示KAE可能通过调控SIRT3相关信号参与线粒体抗氧化防御，但直接结合和功能调控尚需实验验证。

研究结论指出，KAE与NAC联合在SH-SY5Y细胞H₂O₂氧化损伤模型中产生增强的细胞保护效应，协同证据因浓度组合和分析模型而异。增强的保护作用与降低CM-H₂DCFDA荧光和MDA水平、改善抗氧化酶活性和谷胱甘肽氧化还原平衡以及升高SIRT3、FOXO3a和SOD2蛋白水平相关。KAE和NAC可能通过不同但互补的机制参与细胞抗氧化防御。然而，SIRT3/FOXO3a/SOD2通路在KNAC细胞保护效应中的因果作用尚未确立，KAE与SIRT3的直接结合有待生化结合实验、SIRT3活性测定或功能缺失研究验证。此外，体外毫摩尔级NAC浓度能否在人体血浆或脑组织中实现尚不确定，需进一步药代动力学研究和生理相关模型验证。这些初步发现支持将食物来源的KAE与谷胱甘肽前体NAC联合作为增强细胞抗氧化防御的潜在策略，但需更多研究确立因果机制并验证在更具生理代表性模型中的相关性。