《Nutrients》：Proteomic and Phosphoproteomic Profiling of High-Fat Diet-Induced Hepatic Steatosis in Mice
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背景：长期高脂饮食（HFD）摄入会诱导肝脏脂质积累和代谢失调，但其对肝脏蛋白质组和磷酸化蛋白质组的整体影响仍不完全清楚。本研究利用定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术，探讨了HFD诱导的肝脏分子改变。方法：将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组（CON）和
背景：长期高脂饮食（HFD）摄入会诱导肝脏脂质积累和代谢失调，但其对肝脏蛋白质组和磷酸化蛋白质组的整体影响仍不完全清楚。本研究利用定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术，探讨了HFD诱导的肝脏分子改变。方法：将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组（CON）和HFD组，分别饲喂对照饲料或HFD持续16周，随后进行表型评估、血清氧化还原检测以及肝脏蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。结果：HFD喂养的小鼠表现出体重、脂肪量、肝脏重量增加，以及显著的肝脏脂质积累。血糖水平和丙酮酸耐量试验总曲线下面积（AUC）升高，但基线校正后的增量AUC无显著差异。血清丙二醛水平升高，而谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，表明葡萄糖稳态和氧化还原平衡受损。蛋白质组学分析鉴定出15种差异表达蛋白（4种上调，11种下调），这些蛋白与脂质代谢、生物氧化和外源物代谢相关。基因集富集分析（GSEA）发现I类过氧化物酶体膜蛋白输入显著正富集，而胆固醇生物合成、糖异生和外源物代谢显著负富集。磷酸化蛋白质组学分析鉴定出8593种磷酸化蛋白和28180个磷酸化位点，其中包括2045个差异磷酸化位点（1044个增加，1001个减少）。富集分析和探索性网络分析涉及线粒体自噬、葡萄糖代谢、mTOR信号通路、自噬、氧化磷酸化和细胞骨架组织。结论：长期HFD喂养诱导了肥胖、葡萄糖调节紊乱、肝脂肪变性和氧化还原失衡。脂肪酸氧化和过氧化物酶体丰度模式可能反映了肝脏对脂质负荷的代谢适应，而磷酸化位点丰度的变化则将营养感知和自噬调控与肝脏应答联系起来。
研究背景
慢性营养过剩是肥胖及相关代谢疾病的主要驱动因素。高脂饮食（HFD）会破坏全身能量稳态，引发一系列代谢异常，包括肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常和肝脏脂质积累。肝脏作为调节全身葡萄糖和脂质稳态的核心器官，通过协调脂肪酸摄取与氧化、脂质合成与输出、糖酵解和糖异生等过程维持能量平衡。然而，长期HFD摄入会打破这一平衡，导致异常的肝脏脂质积累，伴随氧化应激、线粒体功能障碍、炎症和细胞应激，从而促进代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的发生与发展。值得注意的是，HFD诱导的肝脏脂质积累不能简单地归因于单一的合成或分解代谢途径，而很可能是脂质摄取、利用、储存和输出网络整体失调的结果。此外，蛋白质丰度变化仅是调控的一个层面；许多代谢酶和信号蛋白可通过翻译后修饰快速改变其活性、稳定性、亚细胞定位或蛋白质-蛋白质相互作用。因此，仅凭总蛋白丰度的变化不足以全面解释长期HFD诱导的肝脏代谢功能改变。基于此，研究人员采用定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术，系统表征HFD诱导的肝脏蛋白质丰度和磷酸化水平变化，以期从蛋白质丰度和翻译后修饰两个层面揭示慢性营养过剩引起肝脏代谢异常的分子机制。
研究方法
研究人员使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），随机分为对照组（CON）和高脂饮食组（HFD），每组12只，分别饲喂正常饲料或含60%脂肪供能的高脂饲料，持续16周。主要关键技术方法包括：丙酮酸耐量试验（IPPTT）评估糖异生能力；油红O染色观察肝脏脂质沉积；双能X射线吸收测定法（DXA）测量脂肪量；基于数据非依赖性采集（DIA）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析；使用TiO2磁珠富集磷酸肽后进行磷酸化蛋白质组学分析；免疫印迹（Western blot）验证AKT磷酸化水平；统计分析方法包括独立样本t检验、重复测量方差分析、limma差异丰度分析及Benjamini-Hochberg（BH）多重检验校正。
研究结果
3.1 高脂饮食诱导的肥胖与肝脂肪变性
16周HFD喂养后，HFD组小鼠的体重、脂肪量和肝脏重量均显著高于CON组（p均<0.0001）。油红O染色显示HFD组肝脏出现广泛而密集的脂滴沉积，阳性面积比例显著增加（p<0.001）。丙酮酸耐量试验中，HFD组各时间点血糖水平均显著高于CON组（p<0.05或p<0.01），总AUC显著增加（p<0.001），但基线校正后的增量AUC（iAUC）组间无显著差异。血清丙二醛（MDA）水平显著升高（p<0.001），而谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著降低（p<0.0001），表明HFD成功建立了伴有肥胖、葡萄糖稳态受损、肝脏脂质积累和氧化应激增加的小鼠模型。
3.2 小鼠肝脏蛋白质组鉴定与差异表达蛋白分析
共鉴定到7517种（CON组）和7518种（HFD组）蛋白质，其中7513种为两组共有。基于蛋白丰度谱的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示两组明显分离。经limma差异分析及BH校正后，共鉴定出15种差异表达蛋白（DEPs），其中4种丰度增加，11种丰度降低。增加的蛋白包括CHPT1、ALDH3A2和PEX11A，降低的蛋白包括ACSS2、CYP3A11、CYP3A41A、UGT1A5、UGT1A9、GSTA2和GSTM6等。
3.3 差异表达肝脏蛋白的功能富集与互作网络分析
GO分析显示DEPs主要富集于脂质代谢过程、小分子代谢过程、单羧酸代谢过程和有机酸代谢过程等。KEGG分析映射至类固醇激素生物合成、甘油酯代谢、糖酵解/糖异生、细胞色素P450对外源物的代谢等通路。Reactome分析涉及生物氧化、化合物I相功能化、外源物代谢、谷胱甘肽结合和II相结合反应。GSEA分析发现I类过氧化物酶体膜蛋白输入显著正富集，而胆固醇生物合成、糖异生、生物氧化和外源物代谢显著负富集。探索性PPI网络显示主要功能模块涉及葡萄糖代谢、胆固醇生物合成、脂肪酸合成与β-氧化、过氧化物酶体生物发生与代谢、CYP/UGT介导的代谢以及谷胱甘肽代谢。
3.4 小鼠肝脏磷酸化蛋白质组鉴定与差异磷酸化位点分析
共鉴定到8593种磷酸化蛋白、27942条磷酸化肽段和28180个磷酸化位点。两组间定量数据的变异系数（CV）分布相似。PLS-DA显示两组磷酸化位点丰度谱沿第一主成分明显分离。经limma分析及BH校正后，共鉴定出2045个差异磷酸化位点，其中1044个位点磷酸化丰度增加，1001个位点降低。代表性增加位点包括BNIP3L-S86、CRTC2-S70、RUBCN-S392、SQSTM1-S178、ATG2B-S1571、MAPK3-T203、RPTOR-T865和ULK1-T659；降低位点包括AKT2-Y456、ACLY-S1100、ACAA1A-S36、ACACA-S1258、DLAT-S99、BCL2L13-S302、IRS2-S616、FASN-S980、PRKAG2-S69和ACAA2-T81。免疫印迹证实HFD组肝脏p-AKT（Ser473）/AKT比值低于CON组（p<0.05）。亲本蛋白校正分析进一步确认了BNIP3L-S86、SQSTM1-S178、ATG2B-S1571、MAPK3-T203、AKT2-Y456、ACLY-S1100、ACAA1A-S36、ACACA-S1258、DLAT-S99、BCL2L13-S302和FASN-S980等位点的差异仍然显著。
3.5 差异磷酸化肝脏蛋白的功能富集与互作网络分析
GO分析显示含有差异磷酸化位点的蛋白显著富集于钠离子跨膜转运蛋白活性的正向调控、膜去极化的正向调控、镁离子稳态、cGMP介导的信号传导等生物学过程。KEGG分析显著富集于线粒体自噬-动物、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、氨基酸生物合成、赖氨酸降解、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、紧密连接、肌细胞细胞骨架和Notch信号通路。PPI网络分析揭示的主要功能模块包括mTOR信号通路、自噬与内质网-线粒体接触、线粒体组织与氧化磷酸化、蛋白质稳态与细胞应激反应、脂肪酸合成、脂肪酸β-氧化与过氧化物酶体生物发生、葡萄糖与磷酸戊糖代谢、胆固醇转运、细胞连接与细胞骨架组织以及染色质重塑。
讨论与结论
讨论部分指出，16周HFD喂养不仅诱导了肥胖、葡萄糖稳态受损和肝脏脂质积累，还伴随着血清MDA升高和GSH-Px活性降低，为后续分子分析提供了表型基础。蛋白质组学发现的15种DEPs主要涉及脂质代谢、生物氧化和外源物代谢。值得注意的是，线粒体脂肪酸β-氧化、过氧化物酶体脂质代谢和I类过氧化物酶体膜蛋白导入呈正富集趋势，这被解释为肝细胞在持续脂肪酸流入条件下限制脂质积累的代偿性反应，PPARα是该适应性反应的关键转录调控因子。同时，胆固醇生物合成、糖异生、生物氧化和外源物代谢呈负富集，其中胆固醇合成的抑制可能反映了细胞内胆固醇增多对SREBP2加工的反馩调控。磷酸化蛋白质组学鉴定的2045个差异磷酸化位点涉及胰岛素相关信号（IRS2、AKT2）、营养感知与自噬调控（RPTOR、ULK1、SQSTM1、BNIP3L、RUBCN、ATG2B、BCL2L13）以及脂质代谢酶（ACACA、FASN、ACLY、ACAA1A）等。KEGG分析中线粒体自噬通路的显著富集和PPI网络中mTOR信号-自噬模块的出现，提示HFD可能通过AMPK-mTORC1-ULK1轴影响自噬调控，进而参与肝脏脂滴周转和细胞器质量控制。
研究结论：16周的HFD喂养诱导小鼠出现肥胖、葡萄糖稳态受损和肝脏脂质积累，伴随血清MDA水平升高和GSH-Px活性降低。蛋白质组学分析鉴定出15种差异表达蛋白，主要与脂质和小分子代谢、生物氧化及外源物代谢相关。与脂肪酸β-氧化和过氧化物酶体功能相关的蛋白丰度变化进一步刻画了肝脏对持续脂质负荷的应答特征。磷酸化蛋白质组学分析鉴定出2045个差异磷酸化位点，包括胰岛素信号相关蛋白IRS2和AKT2、营养感知和自噬相关蛋白RPTOR和ULK1，以及脂质代谢酶如ACACA和FASN上的位点。综合来看，这些发现将HFD诱导的肝脂肪变性联系到涉及营养感知、脂质代谢和细胞器稳态的代谢蛋白丰度及磷酸化位点丰度的变化。所鉴定的蛋白质和位点为后续建立其在肝脂肪变性中作用的功能研究提供了候选靶标。
