海藻糖（TRE）与低聚半乳糖（GOS）对Bifidobacterium longum B18冻干存活、细胞完整性及90 d贮藏稳定性的影响：菌株特异性评价

《Foods》：Effects of Trehalose and Galacto-Oligosaccharides on Freeze-Drying Survival and Storage Stability of Bifidobacterium longum B18

　　

在冻干及贮藏过程中维持Bifidobacterium longum B18的活力，是其作为功能性食品益生菌配料应用的关键挑战。本研究筛选了18种冻干保护剂，优化海藻糖（TRE）和低聚半乳糖（GOS）浓度，并评价冻干后存活率、酶活性、膜完整性、形态及90 d贮藏稳定性。8%（w/v）TRE+3%（w/v）GOS配方获得最高冻干后存活率（90.6%）。与磷酸盐缓冲液（PBS）对照相比，该配方冻干后Na⁺/K⁺-ATPase、Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase、乳酸脱氢酶（LDH）和β-半乳糖苷酶活性较高，但相对于单一保护剂的反应因酶而异。定性荧光和扫描电子显微镜（SEM）观察显示碘化丙啶（PI）阳性染色有限，表面损伤较不明显。贮藏期间，所有配方活力均下降。基于描述性比较，4和?20 °C的活力保持率在数值上高于25 °C。90 d后，复合配方在?20和4 °C分别保持49.4%和45.7%存活率，而TRE为38.8%和35.8%，GOS为30.2%和20.3%。25 °C时存活率降至0.1%。然而，由于配方总添加冻干保护剂浓度不同，观察到的差异不能证明TRE和GOS具有互补或协同保护作用。这些发现支持进一步评价8% TRE+3% GOS用于冷藏或冷冻功能性食品，但这项初步90 d研究不能确立商业货架期适用性，需在代表性食品基质中、商业加工、包装和更长贮藏条件下验证。

研究背景与目的：Bifidobacterium longum（长双歧杆菌）B18前期研究显示具有改善睡眠及缓解睡眠剥夺诱导焦虑样行为的潜力。作为益生菌配料开发，必须在加工和贮藏中保持细胞活力与功能。冻干虽便于贮藏和食品应用，但冷冻、脱水和氧化损伤可降低活力，贮藏期亦持续损失。保护效果具菌株依赖性，机制涉及缓解渗透压、限制冰晶生长、形成无定形玻璃态（amorphous glassy matrix）及保护膜和蛋白完整性。TRE和GOS为食品相容保护剂，但B18中TRE单独、GOS单独及TRE+GOS在相同冻干条件下的比较尚缺，故需菌株特异性评价，并将配方与冻干后细胞特征及贮藏活力联系。

关键技术方法：以B18（分离自中国河南信阳健康3岁儿童粪便，GDMCC No. 67383）为对象，先以8%（w/v）筛选18种冻干保护剂，再优化TRE（5–12%）和GOS（1–10%）浓度，并比较8%TRE、3%GOS及8%TRE+3%GOS。冻干条件为?80 °C预冻8 h、36 h冻干（0.04 mbar，冷凝器?84 °C），平板计数计算存活率；测定冻干后Na⁺/K⁺-ATPase、Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase、LDH、β-半乳糖苷酶活性；SYTO 9/PI染色结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察膜完整性；SEM观察形态；在?20、4、25 °C贮藏90 d，每10 d计数。

研究结果：4.1 保护剂类型、浓度及复合配方对B18冻干后存活率的影响：8%（w/v）初筛显示存活率随保护剂类型明显不同，TRE最高（78.6%），GOS次之（46.2%），菊粉、麦芽糊精和脱脂乳分别为35.9%、35.5%和32.3%。浓度优化中，8%TRE和3%GOS分别达82.0%和53.9%；8%TRE+3%GOS组合达90.6%，显著高于单独TRE和GOS（p<0.05）。但因总保护剂浓度不同，不能据此确立互补或协同保护。4.2 对冻干后细胞内关键酶活性的影响：Na⁺/K⁺-ATPase、Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase和LDH在8%TRE及组合组显著高于3%GOS和PBS组，TRE与组合间无显著差异。β-半乳糖苷酶在3%GOS和组合组分别为710.62和775.67 U mg^?1 protein，二者无显著差异，均显著高于8%TRE（533.87 U mg^?1 protein）和PBS（343.05 U mg^?1 protein）；8%TRE亦显著高于PBS。4.3 对细胞膜完整性的影响：SYTO 9/PI染色CLSM定性观察显示，PBS组PI阳性染色较明显，TRE和GOS组较少，组合组以SYTO 9阳性为主且PI阳性有限；但定性观察不能独立确立膜完整性或活细胞比例差异，且总浓度不同，不能归因于TRE与GOS协同。4.4 SEM形态分析：冻干前细胞呈完整杆状、轮廓清晰；PBS组冻干后明显皱缩变形、表面塌陷；TRE或GOS组一般保留可识别杆状但仍有不同程度表面变形；组合组相对完整、轮廓清晰、表面变形较不明显，更接近冻干前。该结果为定性观察，且SEM制备可能引入形态伪影，协同作用仍未解决。4.5 冻干粉贮藏稳定性：第0天活菌数分别为TRE+GOS 1.7×10¹⁰、TRE 1.48×10¹⁰、GOS 1.2×10¹⁰ CFU/g。90 d内所有配方存活率和活菌数逐渐下降，25 °C下降更快；第10天起组合组在各温度下数值最高。?20 °C 90 d存活率为49.4%、38.8%、30.2%，活菌数为8.4×10⁹、5.7×10⁹、3.6×10⁹ CFU/g；4 °C为45.7%、35.8%、20.3%，活菌数为7.8×10⁹、5.3×10⁹、2.4×10⁹ CFU/g；25 °C前10天降至50.1%、33.8%、20.7%，90 d仅0.11%、0.06%、0.06%，活菌数为1.87×10⁷、9.4×10⁶、7.3×10⁶ CFU/g。总体上组合组数值最高，4和?20 °C较25 °C保持更好；贮藏数据仅作描述性汇总，未进行推断统计比较。

讨论总结：原文强调保护效果取决于保护剂类型和浓度。初筛差异明显，优化浓度呈非单调：TRE由5%的42.3%升至8%的82.0%，10%和12%降至55.9%和49.5%；GOS由1%的27.1%升至3%的53.9%，5%–10%逐渐下降。原文提出高浓度可能改变冰形成、水去除、残留水分和干燥基质结构，但未测残留水分、水分活度（a_w）及玻璃化转变温度（T_g），故机制不能确立。组合配方90.6%因总固形物为11%，高于单剂，不能区分组成效应与总浓度效应；需等总固形物对照（如11%TRE、11%GOS、5.5%TRE+5.5%GOS等）及因子或固定总固形物设计。8%脱脂乳仅中等保护，可能与固定浓度、菌株特异及冻干复水条件差异有关。TRE组ATPase和LDH较高，GOS及组合组β-半乳糖苷酶较高；但β-半乳糖苷酶受碳源和菌株调控，不能作为中性活力标志，且未测酶表达和GOS消耗。CLSM和SEM为定性观察，未直接检测蛋白构象、膜脂组织及保护剂–细胞相互作用。贮藏方面，糖限制分子迁移的无定形玻璃态可减缓损伤，但未测T_g、残留水分和a_w，故玻璃态稳定仅为原文提出的可能解释；绝对CFU/g亦受最终粉末质量影响。应用上，TRE和GOS为食品用碳水化合物，结果支持进一步评价冷链食品；GOS本研究主要作为冻干保护剂，未确定其有效剂量或益生元功能，应描述为含GOS益生菌配方而非确证合生元。局限包括单菌株、总浓度混杂、未测残留水分/a_w/T_g/氧暴露、CLSM定性且无活死对照、SEM伪影、90 d仅测活菌而未测酸胆耐受、生长恢复和代谢，贮藏数据未用重复测量或混合效应模型分析。

研究结论翻译：总之，TRE和GOS作为B18冻干保护剂的性能取决于保护剂类型和浓度。在所测试配方中，8%（w/v）TRE+3%（w/v）GOS获得最高冻干后存活率。与PBS对照相比，该配方与冻干后所选酶活性较高及膜和形态损伤较不明显相关；在4和?20 °C贮藏90 d后也显示数值最高的存活率。然而，由于复合配方总保护剂浓度高于任一单保护剂配方，本研究结果不能确立TRE和GOS的互补或协同保护，也不能证明8%TRE+3%GOS是最佳复合配方。25 °C下活力保持差进一步表明在所测条件下需低温贮藏。总体而言，这些初步90 d实验室数据支持进一步评价该配方用于冷藏或冷冻功能性食品，但不能确立商业货架期适用性，需在代表性食品基质中、商业加工、包装和更长贮藏条件下验证。