## 一、专业标题 **Quercus salicina Blume 70%乙醇提取物经调控RUNX2与NFATc1双通路改善去卵巢小鼠骨微结构并双向调节成骨-破骨分化的体内外研究**

《Nutrients》：Adherence to the Mediterranean Diet and Body Composition in Children and Adolescents with Obesity: A Cross-Sectional Study

　　

## 三、摘要翻译

背景/目的：骨质疏松症是一种进行性代谢性骨病，以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨折风险增加。随着人口老龄化，对安全有效的长期骨质疏松治疗手段的需求日益增长，药用植物可能成为骨质疏松新型药物的有前景候选来源。本研究探讨了草本植物槲树叶（Quercus salicina Blume，QS）70%乙醇提取物对骨质疏松的作用。方法：采用小鼠前成骨细胞MC3T3-E1与小鼠巨噬细胞RAW264.7分别评估成骨细胞与破骨细胞分化。以10 mg/kg与40 mg/kg QSEE对去卵巢（OVX）小鼠（绝经后骨质疏松动物模型）经口给药12周，并采用微型计算机断层扫描（Micro-CT）评估骨参数。利用自小鼠股骨与胫骨分离的原代细胞进行离体（ex vivo）实验。通过蛋白质印迹（Western blot）与实时定量PCR（qRT-PCR）检测成骨细胞与破骨细胞相关蛋白及mRNA的表达水平。结果：QSEE通过提高碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨细胞分化相关蛋白与mRNA表达表现出成骨活性。QSEE通过抑制抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性及破骨细胞分化相关蛋白与mRNA表达而降低破骨细胞分化。在OVX小鼠中，QSEE给药恢复了因OVX而降低的骨微结构。在自小鼠股骨分离的原代细胞中，QSEE增加成骨细胞相关标志物并降低破骨细胞相关标志物。结论：上述结果提示，槲树叶（Quercus salicina Blume）通过诱导成骨细胞分化并抑制破骨细胞分化，具有作为抗骨质疏松药物的潜力。

## 四、论文主体解读

骨质疏松症（osteoporosis）是一种以骨量丢失和脆性骨折为特征的代谢性骨病。随着全球人口老龄化，其已成为亟待应对的重大公共卫生问题。骨组织通过骨重塑（bone remodeling）维持结构稳定，该过程依赖成骨细胞（osteoblast）形成骨与破骨细胞（osteoclast）吸收骨之间的持续相互作用；当这一平衡因多种因素被打破时即发生骨质疏松。因此，靶向成骨细胞与破骨细胞的平衡可能成为骨质疏松治疗的有效策略。然而，目前尚无可完全治愈骨质疏松的治疗手段，双膦酸盐（bisphosphonates）与地舒单抗（denosumab）等现有治疗伴有非典型骨折、心血管风险及停药后骨量反弹等严重不良反应，亟需寻找能够克服现有治疗局限的新型替代疗法。槲树叶（Quercus salicina Blume，QS）是自然生长于韩国和日本的一种传统药用草本植物，已知具有抗炎、抗糖尿病、抗菌、抗氧化和抗过敏等活性，其提取物中含大量酚类物质并具高抗氧化活性；叶片中已鉴定出多种酚酸（如没食子酸、鞣花酸）、黄酮类（如槲皮素、山柰酚）以及单宁等生物活性成分。尽管QS的上述生物学活性已被知晓，但其对骨健康的恢复作用仍属未知。研究人员据此假设QS可能成为骨质疏松的潜在治疗药物，并研究了QS 70%乙醇提取物（QSEE）对成骨细胞与破骨细胞分化的影响，同时在给予QSEE的OVX小鼠模型中测定骨参数。

在技术方法上，研究人员采用小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 Subclone 4与小鼠巨噬细胞系RAW264.7分别开展成骨与破骨分化实验；动物实验使用7周龄雌性C57BL/6J小鼠（购自韩国DooYeol Biotech），经双侧去卵巢（OVX）诱导骨质疏松，随机分为假手术组、OVX组、雌二醇+孕酮组（E+P）、QSEE 10 mg/kg组与40 mg/kg组，术后2周开始经口给药、每周5天、持续12周，取左侧股骨行微型计算机断层扫描（Micro-CT），右侧股骨与胫骨用于原代细胞培养；并运用蛋白质印迹（Western blot）、实时定量PCR（qRT-PCR）、碱性磷酸酶（ALP）与抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性测定、茜素红S（ARS）染色、苏木精-伊红（H&E）染色与Ⅰ型胶原（COL1A1）免疫组化，以及高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）进行成分分析。

研究结果显示：第一，QSEE促进MC3T3-E1细胞成骨分化。20与40 μg/mL QSEE不影响细胞活力，可剂量依赖性显著提高ALP活性；Western blot显示QSEE特异性上调Wnt/β-catenin信号相关蛋白β-catenin、RUNX2、OSX与OPN，而TGF-β、BMP水平及其下游磷酸化Smad未见改变；qRT-PCR显示Tgfb1、Alp、Col1a1与Ocn的mRNA表达较分化对照组升高，Runx2 mRNA则无显著变化。抑制剂实验显示MSAB（Wnt抑制剂）、SB431542（TGF-β抑制剂）与Noggin（BMP抑制剂）均降低QSEE诱导的ALP活性，其中MSAB抑制作用最显著，提示其成骨效应涉及Wnt/β-catenin信号。第二，QSEE抑制RAW264.7细胞破骨分化。40与80 μg/mL QSEE不影响细胞活力，可剂量依赖性显著降低TRAP活性；Western blot显示QSEE抑制RANK、磷酸化NF-κB、NFATc1、CTSK与MMP9蛋白水平；qRT-PCR显示Rank、Ctsk、Mmp9、DC-stamp与Trap的mRNA表达呈剂量依赖性下调。第三，QSEE改善小鼠去卵巢诱导的骨质疏松。OVX使子宫重量下降，E+P可逆转该变化，而QSEE对OVX小鼠子宫重量无影响，提示其雌激素样作用并非关键；血清OCN及毒性指标未见显著改变。Micro-CT显示10 mg/kg QSEE可恢复OVX降低的BMD、BS/TV、BV/TV、骨体积、骨表面积、截面面积及骨小梁数目等参数，而40 mg/kg未见相应改变。H&E染色显示OVX所致骨小梁面积减少经QSEE治疗得以恢复，COL1A1阳性细胞水平在OVX组降低而QSEE组升高。第四，QSEE调控原代细胞中成骨与破骨分化。原代细胞ALP活性在QSEE组较OVX组剂量依赖性显著升高；β-catenin、RUNX2与OSX蛋白水平在OVX后降低、40 mg/kg QSEE后升高；Tgfb1、Runx2与Col1a1 mRNA在10 mg/kg QSEE组显著升高；ARS染色显示钙沉积在OVX后减少、40 mg/kg QSEE后增加。原代细胞TRAP活性在QSEE组剂量依赖性显著降低；10 mg/kg组Rank、c-fos、Ctsk、DC-stamp与Trap mRNA降低，40 mg/kg组Rank、Ctsk、DC-stamp与Trap发生改变。离体分析显示Sham与OVX组OPG/RANKL比值无显著差异，QSEE虽剂量依赖性轻度升高该比值但无统计学意义，提示QSEE对破骨分化的抑制作用并非通过调节成骨细胞来源的OPG/RANKL信号介导。第五，QSEE的植物化学成分谱及定量。UHPLC-Q-TOF-MS在正负离子模式下共观察到3个主要峰：峰1经紫外光谱、保留行为及碎片离子与对照品比对鉴定为绿原酸（chlorogenic acid）；峰2与峰3分别显示槲皮素苷元与异鼠李素苷元特征碎片（中性丢失162 Da，提示己糖基），因缺乏糖苷对照品被暂定注释为槲皮素己糖苷（quercetin hexoside）与异鼠李素己糖苷（isorhamnetin hexoside），未确定具体糖基种类及糖基化位置。定量HPLC显示绿原酸为4.2433 ± 0.2854 mg/g干燥提取物，峰2与峰3分别以槲皮素、异鼠李素校准曲线估算为15.2900 ± 0.7923与1.3567 ± 0.1528 mg/g干燥提取物，后两者为苷元当量而非绝对浓度。

讨论部分指出，当前临床治疗如甲状旁腺激素类似物与双膦酸盐主要针对骨形成或骨吸收之一，且长期给药存在局限；近年研究开始关注成骨细胞与破骨细胞活性失衡作为骨质疏松关键致病机制。本研究证明QSEE可同时调节成骨与破骨分化：通过提高RUNX2、ALP等成骨标志物增强成骨分化，同时通过下调NFATc1与TRAP抑制破骨分化，此双重效应在OVX小鼠模型中体现为骨微结构的改善。关于成骨机制，Wnt/β-catenin通路可能是主要驱动因素，TGF-β与BMP通路亦可能较小程度参与。关于破骨机制，QSEE通过调节NFATc1激活及其下游转录网络抑制破骨分化，且其抗破骨作用主要源于对破骨前体细胞的直接抑制，而非经成骨细胞介导。对于OVX模型中低剂量（10 mg/kg）效果优于高剂量的非线性反应，作者提出可能与高浓度下细胞活力或标志物活性阈值轻度下降、10 mg/kg接近小鼠饱和浓度，以及多酚类植物提取物常见的吸收有限、暴露饱和、肠道菌群代谢改变、单宁相关基质效应影响生物利用度、复杂提取物中成分活性相互抵消等因素有关，提示QSEE存在最佳治疗窗，需后续研究完善剂量-反应关系并整合药代动力学/药效学（PK/PD）评价。三种主要酚类成分绿原酸、槲皮素与异鼠李素既往均被报道具有调节骨重塑的抗骨质疏松作用，为其双重调控效应提供了一定的化学基础，但各成分的具体贡献尚不明确，需借助生物活性导向分离与纯化化合物研究加以确定。作者同时指出研究局限：QSEE中具体活性分子未被完全分离鉴定；因单只小鼠可获细胞量有限而采用混合原代细胞，限制了对个体间变异的追踪；体外高浓度下观察到的轻度细胞毒性未在体内表现为明显全身毒性，安全性仍需更严格评估。结论部分译为：总之，本研究证明QSEE通过促进RUNX2介导的成骨作用并抑制NFATc1而发挥对骨重塑的双向调节效应。QSEE治疗显著改善OVX小鼠的骨微结构，其分子效应并通过体外与离体研究得到进一步验证。上述发现为QSEE作为开发抗骨质疏松药物的天然产物候选物提供了有力证据。然而，仍需开展包括活性化合物分离与临床研究在内的进一步研究，以充分确立其治疗价值。