内源性逆转录病毒靶向免疫治疗非小细胞肺癌：HERV-K表达、依赖性及ERV疗法在小鼠模型中的疗效证据

《International Journal of Molecular Sciences》：Endogenous Retrovirus-Targeted Immunotherapy for Non-Small Cell Lung Cancer Supported by Cellular HERV-K Expression, Dependency and Efficacy of ERV Therapy in a Murine Model

　　

人类内源性逆转录病毒-K（HERV-K/HML-2）已被证实与非小细胞肺癌（NSCLC）相关，但其功能相关性及靶向HERV的免疫治疗潜力仍未明确。本研究通过全转录组RNA测序（total RNA-seq）对207例晚期NSCLC患者活检组织中的HERV-K表达进行了表征，观察到HERV-K Gag和Env抗原编码序列的广泛表达。破坏HERV-K102的Env开放阅读框（Env-ORF）与干扰素和抗原呈递程序密切相关，表明其可作为免疫激活肿瘤状态的标志物。在五种具有不同驱动基因突变的NSCLC细胞系中，shRNA介导的HERV-K敲低损害了细胞增殖和存活。在独立实验中，将这些细胞系暴露于治疗相关应激源（包括细胞因子TNF-α和IFN-γ以及化疗药物）后，揭示了HERV-K蛋白积累的动态模式，抗原表达得以保留，在某些情况下甚至有所增加。免疫治疗靶向实验使用ASB-XIV小鼠NSCLC细胞系和鼠ERV替代抗原，通过腺病毒在结构与HERV-K相关的小鼠β-逆转录病毒颗粒上表达鼠白血病病毒（MLV）抗原。该免疫方案能够针对肿瘤攻击产生显著保护作用，并在治疗性处理中与抗PD-L1联合产生叠加获益，从而在鼠替代系统中建立了ERV靶向免疫治疗的概念验证，而非HERV-K靶向疗效的直接证据。研究结果表明，HERV-K在NSCLC免疫生物学中发挥重要作用，靶向HERV-K的适应性免疫应纳入NSCLC患者治疗的探索之中。

**研究背景与问题**

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的80%–85%。以程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）阻断为代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为晚期NSCLC一线治疗的核心，但持久临床获益仍仅限于少数患者，原发性和获得性耐药均十分常见。内源性逆转录病毒（ERV）是远古逆转录病毒感染的残留物，约占人类基因组的8%，其中HERV-K（HML-2）亚组是最新整合且具有生物学活性的谱系，在多种癌症中异常表达，实验证据表明其具有功能相关性而非仅仅是基因组不稳定的副产物。既往研究主要基于治疗初治诊断活检，可能低估了HERV-K在晚期疾病中的存在，且HERV-K在NSCLC中作为免疫治疗靶点的临床意义尚不明确。此外，HERV-K为人特异性ERV，无法在常规小鼠模型中直接评估其靶向疗效，因此需要利用鼠ERV替代系统进行概念验证。

**研究内容与总体结论**

研究人员首先对207例晚期且大多经治的NSCLC患者活检组织进行全转录组RNA测序，评估HERV-K抗原编码序列的表达广度及其与肿瘤转录组通路特征的关联；随后在5种具有不同驱动基因突变的人NSCLC细胞系中评估HERV-K蛋白表达动态及其对肿瘤细胞增殖存活的功能依赖性；最后利用ASB-XIV同系小鼠肺癌模型和腺病毒载体递送的、结构上模拟HERV-K免疫治疗候选药物的鼠ERV替代抗原（嵌合MLV，chimMLV）进行免疫治疗概念验证。研究表明，HERV-K在晚期NSCLC中广泛且冗余表达，是NSCLC细胞生长存活所必需，靶向ERV的免疫治疗联合PD-L1阻断在鼠替代系统中具有抗肿瘤疗效。

**主要关键技术方法**

研究使用了来自丹麦Rigshospitalet I期临床试验单元的207例晚期NSCLC患者新鲜活检组织的总RNA测序数据，以STAR比对至91条HERV-K（HML-2）全长或近全长序列，并采用singscore和fgsea进行通路活性评分；应用慢病毒介导的shRNA在A549、NCI-H460、HCC827、NCI-H1975、SK-MES-1五种NSCLC细胞系中敲低HERV-K Env，以CellTiter-Glo监测细胞活力；以流式细胞术和蛋白质印迹检测细胞因子（TNF-α/IFN-γ）、顺铂及奥希替尼应激下的HERV-K与HLA-I/II、PD-L1表达；构建编码chimMLV的Ad19a/Ad5F35腺病毒载体，在BALB/c小鼠中进行预防性和治疗性免疫，并联合抗PD-L1抗体，以流式细胞术检测MLV特异性CD8⁺ T细胞和抗体应答及肿瘤浸润淋巴细胞。

**研究结果**

**2.1 HERV-K在晚期NSCLC中广泛且冗余表达，K102为免疫关联离群序列。** 通过分析207例晚期NSCLC患者活检组织的总RNA-seq数据，所有肿瘤均表达至少一种抗原编码序列，每个肿瘤中位表达17种抗原编码序列，提示单一序列丢失不太可能消除免疫靶向性。总HERV-K负荷与多个Hallmark通路相关；在所有分析序列中，Env-ORF破坏的HERV-K102是与干扰素和抗原呈递程序关联最强的离群序列，包括I型和II型干扰素、抗病毒防御、主要组织相容性复合体（MHC）II类抗原呈递及TNF-α/NF-κB信号通路，提示其可作为干扰素激活肿瘤状态的标志物；而HERV-K108则与增殖程序相关。

**2.2 NSCLC细胞系中HERV-K表达的治疗相关应激动态。** 研究人员在5种覆盖KRAS突变、EGFR突变及TP53突变特征的人NSCLC细胞系中，通过流式细胞术和蛋白质印迹检测发现，所有细胞系基线均表达HERV-K Env蛋白。经细胞因子（TNF-α/IFN-γ）、顺铂或奥希替尼处理，并在蛋白酶体或溶酶体降解阻断条件下，至少一种HERV-K产物在所有细胞系和所有处理条件下均保留表达，其中经独立抗血清验证的约30 kDa小分子产物尤为稳定。同时，细胞因子在所有细胞系中上调PD-L1表达，顺铂在SK-MES-1细胞中显著诱导PD-L1，而EGFR抑制剂在EGFR突变细胞系中降低PD-L1表达；细胞因子普遍诱导HLA-I，顺铂对HLA-II的诱导作用强于细胞因子。

**2.3 HERV-K支持不同NSCLC亚型肺癌细胞增殖。** 通过慢病毒介导的shRNA在5种NSCLC细胞系中敲低HERV-K Env后发现，所有细胞系的增殖均显著受损，表现为发光信号维持恒定、基本处于非增殖状态，且多数培养物在传代时崩溃，表明HERV-K Env对这些肺癌细胞系的生长和存活具有重要功能依赖性。

**2.4 鼠替代ERV靶向腺病毒免疫治疗介导抗肿瘤活性，并与PD-L1阻断联合具有叠加获益。** 在ASB-XIV同系小鼠肺癌模型中，chimMLV免疫诱导了强烈的MLV特异性CD8⁺ T细胞应答（平均约4%的IFNγ⁺TNFα⁺多功能性CD44^hiCD8⁺ T细胞）和MLV特异性抗体应答，且免疫血清可识别ASB-XIV细胞表面天然MLV抗原。预防性免疫显著延迟肿瘤发生、降低肿瘤负荷，60%的小鼠至研究终点（第80天）仍无肿瘤，而对照组全部在第22天前死亡。治疗性单独给予chimMLV或抗PD-L1均未显著抑制肿瘤生长，但晚期给予chimMLV联合抗PD-L1可显著抑制肿瘤生长并延长生存，10只小鼠中3只实现完全肿瘤消退，约30%长期存活至第90天。肿瘤浸润分析显示，接近完全消退的肿瘤中B细胞频率显著富集。

**讨论与结论**

讨论部分指出，HERV-K（HML-2）作为多拷贝基因家族，肿瘤细胞常同时表达多个序列相关但不同的拷贝，单个序列的失活突变难以实现点突变介导的免疫逃逸，因而HERV-K抗原呈递具有持续性和冗余性。HERV-K表达与肿瘤增殖存活的功能依赖性提示其可能成为癌症的脆弱点。鼠替代实验证实ERV靶向免疫治疗在免疫活性宿主中具有可行性，且与ICIs联合在已建立的肿瘤中产生叠加疗效，这为将HERV-K免疫治疗推向临床提供了概念验证。研究结论认为：抗原编码能力完整的HERV-K Env和Gag在NSCLC患者活检组织RNA水平广泛表达，HERV-K蛋白在人NSCLC细胞系中可检测且对其存活和生长至关重要；在模拟治疗应激条件下HERV-K表达得以保留，支持其作为NSCLC免疫治疗中广泛且持续可用的肿瘤相关抗原；鼠替代Ad-chimMLV免疫治疗在预防性和治疗性联合免疫检查点阻断中均显示出保护效果。这些研究为在NSCLC中开发抗HERV-K免疫治疗提供了支持，并应推动对HERV-K表达依赖性及其在NSCLC肿瘤生物学中调控机制的进一步研究。