基于适体修饰的电解质栅控有机场效应晶体管（EGOFET）传感器实现液体介质中Pb2+与Hg2+的简便、快速、低成本检测

《International Journal of Molecular Sciences》：Simple, Fast and Cheap Pb2+ and Hg2+ Detection in Liquid Media Using EGOFET-Based Aptasensors

　　

铅和汞因其对人类及其他生物的高毒性而属于最危险的环境污染物之列。由于工业废物的排放，二者在各生态系统中亦普遍存在。因此，开发一种简便、廉价的方法以快速检测各类液体（包括废水）中低浓度的上述金属至关重要。基于适体的电解质栅控有机场效应晶体管（EGOFET）传统上用于检测病毒和蛋白质等大型生物分子，而将其用于重金属检测则是一个颇具前景的构想。为实现这一目标，研究人员选取了若干对Pb²⁺和Hg²⁺离子具有高亲和力和特异性的适体，测定了复合物的解离常数与化学计量比，考察了复合物形成的动力学及交叉特异性，并提出了适体–阳离子复合物的结构模型。基于这些适体，研究人员研制了用于Pb²⁺和Hg²⁺检测的EGOFET适体传感器。所制备的EGOFET器件已证明对低浓度铅离子（30 nM至2.5 μM）和汞离子（250 nM至2.5 μM）具有敏感性，上述范围与饮用水中铅的最大允许浓度（144 nM）及废水中铅的最大允许浓度（1.2 μM）相对应，并超过了饮用水中汞的最大允许浓度（5 nM）所对应的范围。尽管如此，在模拟液体流动的模型系统中，利用该EGOFET器件仍可在5 min内检测到浓度为5 nM的汞离子。这表明基于EGOFET的适体传感器有望实现饮用水中最大允许浓度水平下Pb²⁺和Hg²⁺的快速、选择性检测，是发展用于检测液体介质中重金属的流动式传感器的重要一步。

重金属是危害性最强的环境污染物之一，其中铅和汞因高毒性和在生态系统中广泛分布而尤为突出。铅可在人体内蓄积，影响神经、造血和肾脏系统，即使在低浓度下也可对儿童认知发育造成不可逆损害，在成人中则可能导致进展性心血管问题。汞以多种形态存在危害：元素汞吸入后对呼吸系统有毒，盐类损伤肾脏，金属–有机形态（如甲基汞）易穿过血脑屏障并严重损害中枢神经系统。这些金属可沿食物链迁移并长期滞留于环境中，因此对其长期监测是公共卫生与环境保护的重要任务。然而，传统的铅、汞检测方法如原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法需要繁琐的样品前处理、昂贵仪器和 skilled 人员，难以实现连续监测，尤其不利于在实验室外对饮用水、废水或食品样品进行大规模筛查。在此背景下，带有特异性识别元件的即时检测（point-of-care）传感器可作为实验室技术的替代方案。基于EGOFET并以适体为识别元件的传感器传统上用于检测病毒和蛋白质等大型生物分子，也被认为有望用于重金属检测。核酸适体是对靶标具有特异性的寡核苷酸，具有在多种液体介质中稳定、易于合成、对包括重金属离子在内的广泛靶标具有高亲和力等优势。汞的适体识别机制基于Hg²⁺与单链DNA中两个胸腺嘧啶碱基之间的特异性相互作用，汞离子嵌入两个胸腺嘧啶之间形成稳定的T–Hg²⁺–T配对，导致寡核苷酸结构重排，其高选择性可高可靠地将汞与其他阳离子区分。铅的识别则依赖不同结构基序，关键机制之一是Pb²⁺对G-四链体（G-quadruplex）的稳定作用，富含鸟嘌呤的序列可折叠为由平面鸟嘌呤四联体维系在一起的四链结构，铅离子能有效稳定这些构象；但K⁺、Sr²⁺、Na⁺等其他阳离子也可在G-四链体内配位，因此Pb²⁺适体虽具选择性但并非绝对特异，其特异性需加以控制，在其他阳离子过量存在时适用性存疑。开发用于检测铅、汞离子的EGOFET适体传感器的关键问题在于：适体能否不仅在溶液中、而且在固定于EGOFET半导体层表面后仍选择性结合这些离子。为解决该问题，研究人员选取了若干对Pb²⁺和Hg²⁺具有高亲和力与特异性的适体，研究了其复合物的动力学与热力学参数，并据此构建了EGOFET适体传感器。研究人员采用优化的适体与分析物固定化方法，测定了所制备传感器对去离子水、饮用水、废水以及模拟液体流动的模型系统中低浓度（100 nM至2.5 μM）铅、汞及镉（对照）阳离子的敏感性。

在结果部分，2.1节"适体–金属阳离子结合：亲和力与特异性"中，研究人员首先在相同条件下比较了多种适体的亲和力与特异性，适体经生物素修饰以便后续固定于EGOFET受体层，采用等温滴定量热法（ITC）获得相互作用的热力学图谱，包括化学计量比（N）与解离常数（K_D）值，结果证实适体与目标离子的特异性结合，K_D值在数十至数百nM范围；实验中Pb²⁺亲和力甚至高于文献值（如PbGQ的K_D低一个数量级），而适体–Hg²⁺复合物的K_D值比文献高两至三倍；适体在阳离子络合时呈现不同化学计量比，其中HgTT在至少两个络合阶段表现出复杂行为，这些特点可能影响非均相EGOFET传感器的稳健性。鉴于G-四链体形成高度依赖金属阳离子（尤其Na⁺和K⁺），研究人员在高浓度钠离子缓冲液（140 mM NaNO₃）中进行ITC实验，观察到PbGQ和PbGQ2与Pb²⁺结合的热效应下降，可解释为Pb²⁺与Na⁺竞争适体活性结合位点；相反，Hg²⁺适体在钠存在下信号稳定，提示无竞争性抑制并具盐水环境应用潜力。对PbGQ2和HgTT2与尺寸相当的目标阳离子Cd²⁺的交叉特异性研究表明：PbGQ2对镉交叉特异性低，K_D相差两个数量级；而HgTT2对目标阳离子与镉阳离子的K_D仅相差两倍，交叉特异性明显。研究人员利用荧光光谱模式下的停流动力学监测适体–金属复合物的组装动力学，并测试了对其他二价阳离子的交叉特异性；基于高亲和力及既往研究适用性，选取PbGQ和HgTT进行详细研究，考察在不同位置标记荧光素（FAM）的适体变体（PbGQl、PbGQe、HgTT3、HgTT6）与目标及非目标金属离子的相互作用。由于此前推测PbGQ在结合Pb²⁺时二聚化，FAM标记置于5′端（PbGQe）及位于G-四链体环中的第四个核苷酸（PbGQl）。PbGQe快速荧光升高反映标记在二聚化时被挤出堆积，而PbGQl荧光快速下降表明FAM被捕获进入G-四链体沟槽，支持Pb²⁺诱导的G-四链体折叠。荧光测量计算的K_D为34 nM，高于ITC的270 nM，差异可归因于FAM修饰；PbGQe的化学计量比为每个Pb²⁺对应两个适体，与ITC完全一致，而PbGQl为1:1，差异与FAM定位有关，当FAM位于环中时不受二聚化影响，位于末端时在二聚化过程中环境显著改变，故PbGQe数据比PbGQl更可靠；这提示荧光变化应谨慎解读，并应与多种标记变体比较及结合ITC等其他技术。关于汞，研究人员用第三和第六位胸腺嘧啶FAM标记的HgTT变体考察动力学，两者荧光猝灭可能表明FAM与新折叠结构的堆积，最可能指示适体二聚化形成含错配TT对的二聚体；对Hg²⁺的亲和力和交叉特异性取决于修饰位点，HgTT6的K_D最接近ITC数据（均为350 nM），而HgTT3亲和力低三倍且对Hg²⁺/Cd²⁺缺乏特异性，可能因第三位FAM干扰结合位点，HgTT3还显示第二络合阶段的迹象；HgTT6因K_D与ITC相似而被选为更可靠的变体；与HgTT2相比，HgTT对对照离子交叉特异性低，有利于生物传感器性能。所有研究情况下络合均在数秒内完成，与即时检测仪器环境测量的累积检测模式相符。

2.2节"适体–金属复合物结构及复合物稳定性表征"中，研究人员基于ITC和停流动力学数据所得化学计量比及适体序列特征，提出了复合物的潜在结构模型，并用圆二色（CD）光谱验证DNA拓扑结构。亲和力分析显示PbGQ与铅阳离子为2:1化学计量比，鉴于G重复序列为G-四链体特征，推测该适体结合Pb²⁺时形成二聚体，平行G-四链体的另一面被末端核苷酸遮蔽；CD光谱在260 nm显示平行G-四链体的显著峰确认了这一平行结构，加入Pb²⁺后光谱微小位移提示金属与已形成的G-四链体相互作用而非诱导二聚化。CD光谱亦用于评估复合物热稳定性：对PbGQ，在Pb²⁺与适体浓度比10:1条件下，复合物熔解温度为72.6 ± 1.9 °C，比无Pb²⁺时的66.9 ± 1.2 °C高6 °C，因此Pb²⁺稳定PbGQ预先形成的二聚体结构，研究人员预计该适体在EGOFET传感器运行中不会发生显著构象变化。PbGQ2以1:2（适体:金属）摩尔比相互作用，据序列推测其形成反平行G-四链体并嵌入两个金属离子；CD光谱证实无Pb²⁺时PbGQ2折叠为反平行G-四链体（295 nm特征峰），Pb²⁺浓度增加时光谱移至310 nm，表明形成与二价金属阳离子的反平行G-四链体复合物；热稳定性实验显示该适体本身不稳定（T_m = 28 ± 2 °C），过量Pb²⁺显著提高稳定性至72.4 ± 1.1 °C。凝血酶结合适体HD1经ITC显示可与Pb²⁺形成1:1复合物，与PbGQ2类似，游离适体形成反平行G-四链体（295 nm峰结合Pb²⁺后移至310 nm）；"熔解"模式CD显示与Pb²⁺相互作用显著提高HD1热稳定性，熔解温度从无阳离子时的29.3 ± 0.2 °C升至60.5 ± 0.3 °C。对汞阳离子适体，ITC与停流动力学数据分析显示每个Hg²⁺对应两个HgTT适体，随后每条寡核苷酸再被三个Hg²⁺饱和；CD显示无汞时该适体缺乏二级结构，有汞时光谱显著变化指示复合物形成，复合物熔解温度为40 °C。HgTT2适体每个适体结合三个阳离子，由10个胸腺嘧啶残基组成的DNA发夹极不稳定，最可能结构为结合5个Hg²⁺的DNA二聚体；与HgTT类似，HgTT2加入汞后CD谱明显变化，其Hg²⁺复合物热稳定性高，CD谱在温度梯度至90 °C仍保持稳定。CD还用于评估FAM标记对适体性质的影响：无阳离子时PbGQl和PbGQe热稳定性下降（熔解温度分别为56.8 ± 0.9 °C和57.7 ± 0.7 °C，未标记变体为66.9 ± 1.2 °C）；加入Pb²⁺后两种标记适体稳定性提高至78.9 ± 0.8 °C和78.5 ± 0.7 °C，高于未标记序列的72.6 ± 1.9 °C；适体整体结构不变但热稳定性改变5–10 °C。在汞检测方面，HgTT3标记变体灵敏度提高，4 μM Hg²⁺即出现峰位移，未标记HgTT需8 μM，HgTT6则更接近未标记变体。这些数据表明修饰适体变体保持相同结构特征，仅在细节上有差异。

2.3节"EGOFET传感器架构与识别层形成"中，2.3.1小节"识别层优化：适体与链霉亲和素浓度"指出，研究第二步聚焦于基于所选适体的EGOFET传感器开发及性能评价。研究人员此前关于适体作识别元件检测甲型流感病毒的EGOFET研究得到不同构型器件、检出限为6.1?10⁴ VP/mL与8?10⁴ VP/mL，并开发了基于适体pH依赖开关的多传感平台，可在不同pH下检测甲型流感病毒与Ag⁺。基于既往EGOFET研究及适体–阳离子复合物模型的启示，研究人员认为参考文献所述传感器构型可有效检测水介质中的汞和铅阳离子。考虑到甲型流感病毒与阳离子的粒径差异显著以及部分适体–金属复合物的二聚化，需确定EGOFET半导体层表面链霉亲和素与适体的最优含量。为确定最佳链霉亲和素密度，将EGOFET表面用0.1–1 mg/mL链霉亲和素功能化，随后固定荧光标记寡核苷酸，用DMSO回收由链霉亲和素和标记寡核苷酸组成的受体层并分析溶液荧光以评估结合。荧光与寡核苷酸浓度呈线性关系，链霉亲和素浓度超过0.5 mg/mL时响应饱和，故该浓度被接受为最优；此前研究使用较低的0.1 mg/mL，因此需检验更高浓度是否损害EGOFET电学性能，结果发现致密链霉亲和素层不降低器件性能，同一基底上20个器件的转移特性亦显示优异的器件间重现性。为确定适体固定化效率，将带荧光标记的生物素化寡核苷酸（0.2–20 μM）固定在带链霉亲和素层的传感器表面，用DMSO回收并据校准曲线分析荧光。固定化时寡核苷酸溶液浓度增加导致固定量增加，计算显示固定寡核苷酸表面密度达完全占据单层理论最大值的20%，EGOFET表面保留纳摩尔量寡核苷酸；固定化所用微摩尔浓度与洗脱所得纳摩尔浓度之间的差异提示链霉亲和素上许多结合位点存在空间位阻，需显著摩尔过量寡核苷酸方能有效功能化表面。下一步确定适体最佳浓度以获得最佳选择性：传感器对目标汞阳离子相对于对照镉阳离子的选择性取决于表面功能化所用适体溶液浓度，随HgTT和HgTT2适体溶液浓度增加，对汞的选择性下降，表现为在4 μM时两种传感器响应参数——归一化阈值电压（V_th）与跨导（g_m）——对汞和镉阳离子的响应逐渐趋同。EGOFET电学参数的归一化响应按X_apt+Me/X_SA公式计算，其中X_apt+Me为顶层为适体–金属复合物的EGOFET电学参数，X_SA为顶层为链霉亲和素层的EGOFET电学参数。对Hg²⁺检测，HgTT最佳浓度为2 μM，HgTT2最佳范围为2–20 μM（取决于所用响应参数）；而在标记寡核苷酸修饰EGOFET表面的实验中，最佳选择性在适体浓度2 μM时获得，差异可归因于与金属阳离子共同孵育后在传感器表面组装复合物所致的空间位阻。EGOFET传感器的半导体层与生物素化受体层用偏光显微镜（POM）表征，较薄的链霉亲和素、PbGQ和HD1适体层用原子力显微镜表征，各修饰阶段均获得与既往描述相符的成功步骤典型图像。

2.3.2小节"金属阳离子检测技术选择"中，考虑到若干适体–金属复合物中的二聚化可能导致在EGOFET表面直接形成复合物困难，研究人员比较了两种目标阳离子检测方式：一是在适体修饰的传感器表面孵育目标阳离子（连续孵育），二是适体与目标阳离子在溶液中共同孵育后将所得复合物固定于表面（共同孵育）。用HgTT和HgTT2两种适体及2 μM目标（Hg²⁺）与对照（Cd²⁺）阳离子开展实验，传感器响应以归一化电学参数（g_m归一化与V_th归一化）计算，连续法用X_apt/Me/X_SA、共同法用X_apt+Me/X_SA公式，其中X_apt/Me为顶层为连续法固定阳离子的EGOFET电学参数。信号采集与分析均显示数据分布存在显著差异，且孵育方式对目标与对照阳离子的传感器选择性很重要；共同孵育技术在区分目标（Hg²⁺）与对照（Cd²⁺）离子响应方面优于连续孵育，但两种情形下均可选择一种响应参数（如共同孵育的g_m或连续孵育的V_th）区分目标与对照阳离子；共同技术在可用参数方面更通用，例如HgTT适体的跨导对Hg²⁺与Cd²⁺的传感器响应相差约5倍，归一化g_m值在多个EGOFET像素间离散度最低、误差最小；基于HgTT2的EGOFET器件稳定性和选择性较低，后续灵敏度实验亦有同样现象。用三种Pb²⁺特异性适体、2.5 μM浓度进行同样实验，与汞检测相比，连续技术在区分目标（Pb²⁺）与对照（Cd²⁺）方面效果更好，归一化g_m与V_th在连续技术中均有信息量，而共同孵育中仅V_th可较低效率地区分铅与镉；该趋势在三种适体中均保持，表明铅与EGOFET层之间存在特异性相互作用。

2.4节"汞与铅EGOFET适体传感器的校准曲线"中，研究人员选取PbGQ2与HgTT适体用于后续实验，因其目标与对照阳离子间亲和力相差1000倍，且在EGOFET中对目标与对照阳离子的选择性优于其他适体。汞检测中跨导被证明是最佳响应参数，因其对目标（Hg²⁺）与对照（Cd²⁺、Pb²⁺）离子响应分离更好；归一化跨导随汞浓度增加而升高、随镉和铅浓度增加而降低，表明EGOFET电学性能在汞存在下改善、在镉和铅存在下退化。空白变异性按g_{m Apt}/g_{m Apt AVG}公式计算，其中g_{m Apt}为适体修饰表面EGOFET在水滴中测得的跨导、g_{m Apt AVG}为相应基底平均跨导；HgTT适体空白变异为1.00 ± 0.03，据此并结合回归方程，以空白响应的3δ和6δ偏差计算得Hg²⁺检测的检出限（LoD）为250 nM、定量限（LoQ）为1000 nM。PbGQ2适体EGOFET校准曲线中，跨导同样为最佳响应参数；响应参数按X_apt+Me/X_apt公式计算，其中X_apt为顶层为适体的EGOFET参数，该归一化方式仅计入金属阳离子固定相关的变化并消除底层功能层对电学性质的影响。校准曲线显示，对照镉阳离子存在下跨导无显著变化，在广泛Cd²⁺浓度范围内归一化跨导约为1.0；相反，铅阳离子存在时即使Pb²⁺浓度低至100 nM也使跨导下降近2倍（降至0.55 g_{m, apt}），且跨导对Pb²⁺的响应在所测浓度内呈平台状。PBGQ2器件空白变异为1.00 ± 0.08，表明对Pb²⁺的所有响应均超出按3δ偏差计算的器件空白变异；归一化阈值电压可用于30 nM至250 nM铅阳离子传感，更高浓度时响应饱和，其空白变异为1.00 ± 0.05，据此并以空白响应3δ偏差计算得铅的LoD为30 nM。为研究EGOFET层与金属阳离子的非特异性相互作用，研究人员对目标（Pb²⁺、Hg²⁺）与对照（Cd²⁺及相应Pb²⁺）离子在生物素化、链霉亲和素覆盖及修饰SARS-CoV-2病毒特异性且对金属阳离子非特异性RBD-1C适体的不同EGOFET表面进行对照实验，响应参数按X_layer+Me/X_layer公式计算，其中X_layer+Me为金属阳离子与对照层相互作用的EGOFET参数、X_layer为无金属阳离子的EGOFET参数；所得数据提示EGOFET传感器的归一化跨导与目标金属阳离子和适体之间的特异性相互作用相关联。

2.5节"基于累积的低浓度汞和铅阳离子检测测试"中，EGOFET器件被证明对低浓度铅（30 nM至2.5 μM）和汞（250 nM至2.5 μM）阳离子敏感，这些范围与鱼类养殖水体及饮用、废水中铅的最大允许浓度（分别为30、144 nM和1.2 μM）相对应；对汞而言，所报告范围远高于饮用和废水中5 nM的最大允许浓度。然而，EGOFET传感器通过累积模式可在模拟水流条件下检测这些阳离子的低浓度：研究人员将EGOFET适体传感器置于含低浓度目标或对照阳离子、持续搅拌的自来水烧杯中，于15、30、60、300和600 s时取出传感器测量响应；测量使用HgTT适体传感器在含5 nM Hg²⁺或30 nM Pb²⁺的水溶液中进行，烧杯直径4 cm、体积18 mL，搅拌速度1500 rpm，对应角速度1.0 m/s，与管道中0.6–1.5 m/s的水流速度相近，确保所开发传感器能准确测量水流中的阳离子浓度。为考虑器件退化与基线漂移，传感器响应按Δg_m归一化 = g_m归一化（Me）? g_m归一化（自来水）计算，其中g_m归一化（Me）= g_m（Apt+Me）/g_m（SA）、g_m归一化（自来水）= g_m（Apt+自来水）/g_m（SA）。结果表明，将EGOFET传感器浸入测试溶液后5 min内可可靠检测5 nM汞，并能与30 nM铅溶液的响应区分；汞存在时EGOFET跨导较自来水中升高，而铅存在时较自来水中降低。

讨论部分指出，目前水中重金属检测使用传统光谱与质谱技术，包括原子吸收光谱（AAS）、原子发射光谱（AES）、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等最为常用。AAS通过高温火焰或石墨炉原子化后测量光吸收以定量水中重金属，如对50份水样中铅、砷、锑、铝的浓度测得1–7.8 μg/L；AAS在高浓度和大体积样品时更有效，但需逐一分析目标因而较慢。AES适用于含多种元素的复杂样品，金属原子被激发并发射各元素特异的发射光谱，采用电感耦合等离子体等高温原子源（温度达6000–10000 K）可显著提高金属发射强度、加快分析并提高灵敏度，例如用ICP-AES检测水介质中Co²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺和Mn²⁺的检出限为0.3–1 μg/L。ICP-MS利用样品中金属组分电离后按质荷比（m/z）分析带电粒子，重金属检出限约1 ng/L–1 μg/L，适用于复杂样品中多元素同时分析、具高准确度和分辨率。传统方法灵敏、可靠、重现性好、可同时检测多目标，但受设备昂贵、需 skilled 人员和分析耗时限制，且不能连续分析。相比之下，生物传感器系统提供成本效益高、紧凑便携的替代方案，可在采样现场直接快速分析，包括连续在线流动测量；电化学生物传感器最常用于重金属检测，光学和比色生物传感器也在开发中。基于适体的生物传感器尤其受关注，因这类生物分子易于整合入传感器并在检测重金属阳离子时表现出高特异性。本研究表明适体对Pb²⁺和Hg²⁺的特异性并非绝对：基于G-四链体的Pb²⁺适体因与Na⁺竞争结合位点在盐水中效率不高；汞适体对Cd²⁺存在交叉特异性，两者同属周期表同一族且离子半径相近（分别为1.02 ?和0.95 ?），这些脱靶相互作用在生物传感器开发和数据解释时应予考虑。基于适体的生物传感器已成功用于Pb²⁺和Hg²⁺检测，多数报道以荧光为分析信号；本研究首次证明适体可用于EGOFET传感器特异性检测Pb²⁺和Hg²⁺。由于EGOFET生物传感器典型分析物（蛋白质和病毒）尺寸远大于重金属阳离子，EGOFET表面链霉亲和素浓度由0.1增至0.5 mg/mL以提高适体固定密度并增强传感器灵敏度而不降低电学性能。考虑到部分金属–适体复合物二聚化，还提出了将金属阳离子沉积到EGOFET表面的替代方法即阳离子与适体在溶液中共同孵育，该方法对汞阳离子具有更优选择性。EGOFET适体传感器可基于与目标及对照阳离子相互作用时电学性质的不同变化将汞与镉、铅区分。ITC测量表明基于G-四链体的适体因与Na⁺竞争而不能用于盐水；此外K⁺与这些适体的结合亲和力比Pb²⁺低4–12倍；同时所有累积实验均使用未经额外纯化的自来水，表明所开发传感器适合在其他阳离子存在下检测自来水中的目标阳离子，自来水中Ca²⁺和Mg²⁺浓度为1.9–5.7 mg-ekv/L（47 nM–142 nM）、Fe²⁺和Fe³⁺浓度为0.1 mg/L（1.8 nM）、Cu²⁺和Cd²⁺浓度分别低于1.0 mg/L和0.001 mg/L。实验表明铅和镉可直接与EGOFET表面相互作用，证据是对对照阳离子的阈值电压响应：对HgTT适体，归一化阈值电压参数在100 nM至2500 nM范围内对Pb²⁺浓度呈明显依赖；对PbGQ2适体，归一化阈值电压参数在100 nM至500 nM范围内对Cd²⁺浓度有依赖，研究人员将其归因于Pb²⁺和Cd²⁺离子与链霉亲和素或生物素化受体层的直接相互作用，尚需进一步研究以理解该相互作用机制及阈值电压与器件表面物理过程的关系。需指出本研究所述传感器为一次性使用，因识别元件适体直接位于EGOFET表面并通过生物素–链霉亲和素相互作用牢固连接；而研究人员此前工作描述了可重复使用的甲型流感病毒EGOFET适体传感器，其适体识别层固定在置于EGOFET表面的可弃式、易更换聚合物径迹蚀刻膜上，该器件架构有可能也用于金属阳离子检测。关于检出限，其在水滴中测定，并非其他生物传感器中最低，但与铅在鱼类养殖水体、饮用水和废水中的最大允许浓度（分别为30、144 nM和1.2 μM）相当；同时汞的LoD高于饮用水和废水中5 nM的最大允许浓度，为克服这一限制，提出了基于累积的检测低浓度汞的方法，将EGOFET传感器置于含汞（5 nM）、铅（30 nM）或镉（30 nM）的持续搅拌自来水烧杯中，于15、30、60、300和600 s测量传感器响应，该系统模拟水流中测试，通过金属阳离子在EGOFET表面的逐渐累积获得响应，此方法因所选适体具有高结合常数而可行，并证明可区分5 nM汞与30 nM铅。因此，所开发生物传感器性能适合检测超过饮用水和鱼类养殖水体最大允许浓度的汞和铅的实际应用。

结论部分译述如下：总结所获数据，研究人员首次证明适体可用于EGOFET传感器以简单、快速、特异且低成本的方式检测液体介质中的Pb²⁺和Hg²⁺。尽管基于EGOFET的适体传感器传统上用于检测病毒和蛋白质等较大生物分子，其在解决重金属检测问题上亦具前景。为实现这一潜力，研究人员选取了若干对Pb²⁺和Hg²⁺具高亲和力和特异性的适体，测定了其与目标及对照阳离子复合物的解离常数和化学计量比，研究了复合物形成动力学并确定了交叉特异性，还提出了适体–阳离子复合物的推测结构。基于这些适体，研究人员构建了用于Pb²⁺和Hg²⁺的EGOFET适体传感器。由于EGOFET生物传感器典型分析物（如蛋白质和病毒）尺寸远大于重金属阳离子，并考虑到若干金属–适体复合物的二聚化，研究人员提高了EGOFET表面链霉亲和素浓度，并优化了适体浓度及分析物被EGOFET表面捕获的方法以提高传感器灵敏度。所制备EGOFET器件被证明能够检测低浓度铅（30 nM至2.5 μM）和汞（250 nM至2.5 μM）阳离子，与铅在饮用水和废水中最大允许浓度144 nM和1.2 μM相应，但高于汞在饮用水和废水中5 nM的最大允许浓度。尽管如此，利用所制备EGOFET在模拟液体流动的模型系统中证明了5 min内检测5 nM汞阳离子的可能性。水滴中标准测量的检出限确定为铅阳离子30 nM、汞阳离子250 nM，这些值实质上受限于2.5 μL分析溶液液滴内目标阳离子的量；而在累积模式下，传感器响应由结合于EGOFET表面适体上的金属阳离子逐渐累积决定，归因于所选适体的高结合常数，且仅受器件在水流中退化速率的限制，因此可实现基于累积的5 nM汞阳离子检测。还应指出，分析耗时不超过10 min，无需复杂样品前处理（可使用一滴自来水或饮用水而不需任何标记），并可在实验室外使用所述便携设备完成。最终器件的低成本基于市售低成本C8-BTBT有机半导体和适体，以及制造一个传感器仅需极少量材料（仅几纳克）；硅基底可替换为廉价玻璃晶圆。EGOFET传感器设计上兼容可扩展、低成本的溶液加工和印刷制造技术（如喷墨打印、旋涂或本研究所用刮刀涂布），使大批量生产时每器件制造成本约一美元。因此，研究人员首次实现了利用EGOFET适体传感器在饮用水和鱼类养殖水体最大允许浓度水平下快速、选择性检测Pb²⁺和Hg²⁺离子的概念验证，为液体介质中重金属检测的流动式传感器开辟了道路。

关于主要关键技术方法（约250字以内）：研究采用等温滴定量热法（ITC）测定适体–金属复合物的解离常数与化学计量比；圆二色（CD）光谱用于解析DNA拓扑结构并测定熔解温度；荧光光谱模式停流动力学（stopped-flow）考察复合物形成动力学；器件方面，以重掺杂n型硅片（热氧化SiOx 300 nm）为基底、热蒸镀金叉指源漏电极，经氧等离子体处理及五氟苯硫酚修饰后，以刮刀涂布C8-BTBT-C8:聚苯乙烯（4:1）共混物形成有机半导体层，再以Langmuir–Schaeffer技术沉积含30% BTBT-生物素的生物识别层；以去离子水为电解质、铂丝为栅极，用Keithley 2634B源表在探针台上进行电学测量，以Shockley渐变沟道模型提取场效应迁移率并计算饱和区跨导；用原子力显微镜和偏光显微镜表征各层；用荧光分光/拉曼光谱评估寡核苷酸固定效率；累积实验在自来水中进行（样品来源为自来水，未注明具体采集地点）。