《International Journal of Molecular Sciences》：Integrated Host Genome Rumen Microbiome Metabolome Prediction of Low-Methane, High-Feed-Efficiency Sheep Under Climate Stress
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绵羊能够很好地适应边缘化放牧系统，并提供羊毛、奶和肉等重要产品。然而，瘤胃和网胃中的微生物发酵会产生肠道甲烷，这增加了畜牧业生产的温室气体排放。甲烷排放和饲料效率均表现出可遗传变异，同时宿主遗传学可通过复杂的宿主-微生物互作塑造瘤胃微生物组成。本综述探讨了如何
绵羊能够很好地适应边缘化放牧系统，并提供羊毛、奶和肉等重要产品。然而，瘤胃和网胃中的微生物发酵会产生肠道甲烷，这增加了畜牧业生产的温室气体排放。甲烷排放和饲料效率均表现出可遗传变异，同时宿主遗传学可通过复杂的宿主-微生物互作塑造瘤胃微生物组成。本综述探讨了如何将宿主基因组学、瘤胃微生物组谱系、产甲烷古菌群落以及瘤胃和血液代谢组学相结合，以识别低甲烷排放和改善饲料效率的生物标志物，尤其是在环境胁迫条件下。证据表明，甲烷产量具有可重复性和遗传影响，且瘤胃微生物组组成与甲烷排放和饲料效率相关，尽管现有证据并未显示特定微生物类群直接导致这些性状。因此，整合宿主基因型与微生物及代谢信息可能改善对甲烷排放和剩余采食量（residual feed intake, RFI）的统计预测，但这不同于识别经过验证的生物标志物或证明生物学因果关系。尽管如此，可靠的微生物生物标志物尚未建立，且跨品种、日粮和生产环境的验证仍然有限。热应激通过改变瘤胃发酵、氧化状态和微生物群落结构进一步增加了复杂性，然而在气候胁迫下的整合组学研究仍然稀缺。未来研究应优先采用纵向、多品种设计，标准化的甲烷表型测定，以及协调的多组学分析，以开发用于可持续、低排放绵羊生产的稳健生物标志物。
1. 引言
绵羊在利用不适合作物生产的放牧地方面发挥重要作用，能将纤维性植物材料转化为肉、奶和毛等有价值的产品。然而，这一独特能力依赖于瘤胃微生物发酵，该过程也产生甲烷作为副产物。肠道甲烷是绵羊生产温室气体足迹的重要组成部分。肠道甲烷也是一种日粮能量的损失：动物摄入的部分总能以甲烷形式流失，而非用于维持或生产。因此，降低甲烷输出可能释放更多能量和营养物质用于生长、羊毛、奶或肉，但这种收益并非自动实现，取决于节省能量的去向。因此，在保持生产效率的同时减少绵羊肠道甲烷排放已成为多个国家重要的育种和管理目标。两个观察结果支持针对低甲烷排放的选择性育种。首先，绵羊的甲烷性状具有遗传力和可重复性。其次，动物个体间瘤胃微生物组存在差异，且部分变异与宿主遗传学相关。瘤胃微生物图谱因此可作为独立的表型进行研究，或作为难以直接测量的性状的潜在替代指标。饲料效率为甲烷减排策略增加了另一层复杂性。更高效的绵羊通常摄入较少饲料却能维持相同生产水平，这通常意味着较低的绝对甲烷排放。气候胁迫使情况进一步复杂化：升高的热负荷会改变采食量、瘤胃发酵、氧化应激生理以及瘤胃微生物组组成和功能。因此，在热中性条件下构建的预测模型应用于面临热应激、限水或低质量饲草的动物时可能表现不佳。没有任何单一数据类型足以完全解释甲烷排放和饲料效率背后的生物学变异。宿主基因型捕捉了可遗传、可传递的部分，但仅解释了部分表型。微生物组是发酵的工作机器，但它受日粮影响且部分短暂。代谢组展示了生化输出，但仅是快照。本综述认为这些分子层包含互补且部分独立的信息，它们的整合已显示出改善绵羊甲烷排放和饲料效率预测的潜力。剩余的挑战在于开发稳健的多组学方法，使其在绵羊经历的不同环境条件下仍具预测能力，包括气候相关胁迫因子。早期的综述大多将宿主基因组学、瘤胃微生物组和代谢组学视为独立的证据线索。本综述将这三者结合于绵羊中，并探究热应激及其他气候压力如何改变它们之间的联系。其目标是：总结甲烷和饲料效率性状在绵羊中的遗传力和可重复性证据；评估瘤胃微生物组、古菌组和代谢组图谱对这些性状预测的附加价值；描述宿主基因组、微生物和代谢数据在绵羊中实际结合的程度；指出热应激引入的研究空白，以便为经过验证的、气候适应性强的低甲烷高效绵羊生物标志物勾勒出框架。
2. 绵羊肠道甲烷排放
甲烷由瘤胃中的产甲烷古菌产生，这些古菌利用饲料微生物发酵过程中产生的氢气和二氧化碳。产甲烷作用通过将CO2和H2转化为CH4充当氢汇，从而维持瘤胃氧化还原平衡，防止破坏微生物发酵的氢气积累。产甲烷作用是瘤胃中的主要氢汇，但并非唯一途径。丙酸形成、还原性乙酸生成、不饱和脂肪酸的生物氢化以及硫酸盐或硝酸盐还原也能消耗氢气。甲烷输出还取决于日粮、氢气供应、微生物互作和宿主生理，而非仅依赖产甲烷菌数量。占主导地位的产甲烷古菌群在不同动物宿主和地理区域间相对一致。全球瘤胃普查分析了来自35个国家32种宿主物种的742份瘤胃和前肠样本，发现尽管宿主和环境差异巨大，少数古菌群始终占主导地位。细菌发酵和氢气供应的变异即使在优势古菌群相似的情况下也可能导致甲烷差异。挥发性脂肪酸（volatile fatty acid, VFA）谱在此处至关重要：发酵生成乙酸和丁酸会释放氢气，而发酵生成丙酸则消耗氢气，因此将碳流向丙酸的瘤胃留给产甲烷作用的氢气更少。Kamke等人发现，低甲烷产量的绵羊中富集了产乳酸的Sharpea属，并提出增加的乳酸产量及其后续转化为丁酸，可将还原当量从产甲烷途径转移，从而降低每单位己糖发酵的甲烷产量。类似的原理也存在于将发酵转向丙酸的日粮策略中。乙酸-丙酸平衡还将产甲烷作用与宿主保留的日粮能量联系起来。甲烷代表以气体形式损失的饲料能量，而非被动物捕获，因此将发酵转向丙酸既可提高能量保留率，也可减少排放。但这关系并非必然：乙酸也是重要的能量底物和乳脂及体脂前体，不加区分地抑制乙酸生成可能损害动物性能。因此，甲烷产量和甲烷强度通常比绝对排放更具信息量。
3. 饲料效率与低甲烷表型
剩余采食量（residual feed intake, RFI）是反刍动物研究中衡量饲料效率最常用的指标，计算为动物实际采食量与基于其体重和生产水平预测值之间的差值。低RFI值的动物消耗的饲料少于预期，同时维持可比的生产水平，因此被认为更高效。由于采食量影响瘤胃中氢气的生成和甲烷形成，低RFI的动物可能也产生较少甲烷。在美利奴绵羊中，研究发现采食量、RFI和甲烷排放之间存在强遗传相关，表明选择改良饲料效率可能有助于减少甲烷产量。然而，一项荟萃分析估计了甲烷产量与RFI之间以及甲烷产量与采食量之间更为适度的遗传相关。因为RFI是对体重和生产回归后的残差，它比原始采食量更能公平地比较不同体型和产量的动物。在热中性条件下测定的效率排名在热应激下可能不再成立。这些相关性主要描述甲烷产量，而甲烷产量受采食量强烈影响。当甲烷排放根据采食量调整后，剩余变异较小，与生产性状的关系也更弱。因此，选择那些在生产水平一定时消耗较少饲料的动物可以减少总甲烷输出。相比之下，选择较低的甲烷产量代表不同的育种目标，可能不会直接改善生长或羊毛产量。在实践中，识别低甲烷动物仍主要依赖直接甲烷测量。然而，成本和劳动投入促使间接指标和早期生命预测因子的发展。一项研究表明断奶后可测量气体相关性状，并将更容易测量的二氧化碳确定为采食量的有用指标。另一项研究将此代理指标方法扩展到经产母羊。来自低甲烷品系的母羊产的奶含有更多多不饱和脂肪酸和支链脂肪酸，以及更少的饱和脂肪。源于奶或瘤胃组成的代理甲烷性状具有遗传力，与实测甲烷的遗传相关在0.52至0.71之间。虽然有些出乎意料，但基于奶的代理指标优于瘤胃VFA图谱，凸显其作为间接选择实用指标的潜力。甲烷产量、甲烷产量和饲料效率是相关但独立的性状，不应被视为可互换的选择目标。
4. 宿主基因组对甲烷和饲料效率的贡献
绵羊甲烷排放的宿主遗传贡献证据主要来自低至中等遗传力估计。研究估计日甲烷产量的遗传力为0.29，甲烷产量为0.13，相应的两周测量重复性分别为0.55和0.26。在放牧绵羊中使用便携式累积室，报告羔羊和母羊的甲烷遗传力分别为0.19和0.20，羔羊与母羊测量值间的遗传相关为0.99。这些发现支持在遗传评估中使用早期生命甲烷表型。一项荟萃分析报告甲烷相关性状的平均遗传力为0.137至0.250。宿主可通过遗传和生理相互作用影响瘤胃微生物群落结构，为宿主基因组与微生物组提供概念联系。几种机制已被提出但大多未经检验：宿主对瘤胃上皮结构和吸收的控制、唾液成分和缓冲能力、黏膜免疫和抗菌肽、瘤胃pH值和运动性，以及采食行为和采食率的可遗传差异。Hess等人分析了来自1708只绵羊的4479份瘤胃宏基因组样本，发现若干微生物属的丰度是可遗传和可重复的，部分效应在不同日粮条件下仍可检测到。尽管如此，整体微生物群落组成仍主要由环境因素塑造。可遗传部分使得基于微生物组的选择成为可行策略。基因组预测将可遗传变异转化为可用于选择的估计育种值。Ross等人对99只动物的残余甲烷表型进行基因组预测，单独使用基因组关系矩阵的预测精度在0.058至0.220之间。Hess等人通过整合1200只母羊的宿主基因型与瘤胃宏基因组图谱，报告了对甲烷排放和剩余采食量的预测显著优于单独使用基因组信息，特别是纳入早期生命的微生物图谱时。绵羊中的一个主要限制是缺乏对甲烷排放和饲料效率背后因果遗传变异的高分辨率认识。目前的遗传力估计和基因组预测方法主要依赖全基因组关系而非已识别的数量性状位点或功能特征基因。
5. 瘤胃微生物组、古菌组与甲烷表型
瘤胃微生物组通过其功能能力而非仅仅分类学组成得到更好理解，因为不同的微生物群落若能趋同于相似的发酵策略，可产生相似的甲烷表型。氢气的可用性和利用是将微生物活性与甲烷产量联系起来的核心机制。绵羊中古菌群落变化不大。Malik等人发现氢营养型Methanobrevibacter物种主导绵羊古菌组，甲烷形成主要由CO2还原途径支持，甲基营养型产甲烷作用贡献较小。由于古菌分类学差异本身可能无法完全解释甲烷排放变异，更具信息的预测信号可能来自调节氢气产生、转移和利用的细菌群落和功能通路。对比细菌模式说明为何需要在物种、菌株和实验背景下解读关联。Kamke等人鉴定了低甲烷产量绵羊中Sharpea富集的微生物组，其宏基因组和宏转录组证据与乳酸形成和利用一致。在另一项研究中，他们将细菌III型分泌基因与更高甲烷产量相关联。Sato等人发现在接种绵羊瘤胃液的批量培养中，丙酸相关属的变化伴随甲烷减少。Prevotella是许多绵羊瘤胃数据集中最丰富的细菌属，但其代谢多样性意味着属水平的丰度是甲烷的粗略预测因子。原生动物和真菌是绵羊甲烷文献中解析最不充分的组分。原生动物将氢气传递给产甲烷菌并与它们物理关联，因此去原虫化可降低甲烷。厌氧真菌降解纤维并产生氢气，但它们对绵羊个体间甲烷变异的贡献仍未充分表征。
6. 瘤胃与血液代谢组学
代谢组学图谱描述了可能有助于解释甲烷相关表型变异的生化过程。Bilton等人报告低甲烷选择品系母羊的瘤胃乙酸-丙酸比例较低。Ross等人使用基于代谢物的关系矩阵预测99只绵羊的残余甲烷，在两个测量时间点的预测精度分别为0.254和0.132。外周脂质代谢物提供了额外优势，因为它们无需直接瘤胃取样即可测量。低甲烷母羊的奶含有更高比例的多不饱和脂肪酸和支链脂肪酸，以及更低的总饱和脂肪酸水平。在该研究中，基于奶的代理指标显示出比瘤胃VFA测量更大的潜力。除VFA和脂肪酸外，绵羊中的代谢组学证据仍然有限。氨基酸、胆汁酸以及与能量或氧化应激相关的代谢物已被提议作为反刍动物饲料效率和生理状态的潜在生物标志物，但将特定血液代谢物图谱与绵羊甲烷排放联系起来的研究很少。环境胁迫下代谢组学反应的最强证据来自气候研究而非甲烷研究。热应激公羊的非靶向代谢组学显示瘤胃和精液代谢组的实质性重组，包括皮质醇和类固醇相关通路的变化以及某些代谢物的减少。这证实瘤胃代谢组对热应激有响应，但这些变化是否与同一动物的甲烷产量相关仍未知。
7. 绵羊的气候胁迫
气候胁迫通过几个相互关联的途径影响瘤胃，包括采食量的减少和变化、对高温的直接生理反应、饲草质量和可用性的下降以及饮水受限。在这些胁迫因子中，热应激在使用组学方法的绵羊研究中得到了最广泛的研究。这些研究已识别出与生理反应和日常代谢模式改变相关的分子和微生物变化。热应激激活宿主的氧化应激通路和热休克反应，对动物健康、福利和生产造成不利影响。Su等人研究了温度-湿度指数为79.7条件下的240只育肥羔羊，评估草药补充剂对生理和瘤胃微生物反应的影响。热应激对照组羔羊血清热休克蛋白浓度升高，抗氧化酶活性改变。最有效的补充剂减少了这些应激标记物，改善了生长性能，并通过增加Prevotella丰度和改变其他微生物种群来修饰瘤胃微生物群落。同样，在热应激羔羊中补充姜黄素纳米胶束改善了瘤胃发酵的多项指标。这些研究共同证明热应激破坏瘤胃功能，且营养干预可改善热应激下的发酵。然而，现有证据主要来自短期饲养试验，并未确定热应激如何影响甲烷排放性状的遗传变异或基因型-环境互作。因此，尽管气候胁迫与甲烷强度之间的联系在机制上合理，但在绵羊中仍未得到充分表征。干旱、饲料短缺、劣质饲草和限水对于广泛绵羊系统而言可能是更重要的气候压力，但在瘤胃组学文献中几乎未被涉及。这是一个重大空白，因为在营养良好的温带羊群中鉴定的低甲烷基因型可能在炎热、饲料受限的环境中无法保持其优势或其微生物组配置。
8. 多组学整合
Ross等人的绵羊概念验证研究结合了来自99只动物、跨越三年的基因组、瘤胃代谢组和微生物组信息。基因组预测精度范围为0.058至0.220。添加代谢组信息在一个时间点将精度从0.201提升至0.274，在另一个时间点从0.081提升至0.158；添加微生物组信息在一次比较中将精度从0.216提升至0.247。这些适度增益表明互补的预测信息，但小群体和研究特定的验证并不能确立跨独立品种、日粮或气候的性能。Hess等人使用限制性酶简化代表性测序分析了来自1200只母羊的3139份瘤胃样本，并结合宿主基因组和微生物信息预测甲烷排放、剩余采食量及其他性状。无参考微生物图谱通常优于有参考图谱。Bilton等人将基于微生物组的甲烷预测扩展至4585只羔羊，报告与日甲烷产量的遗传相关为0.75，与甲烷比率的遗传相关为0.64。这些相关性支持使用微生物图谱作为候选代理性状，但不能等同于个体预测精度。大多数已建立的绵羊多组学预测研究使用混合模型和关系矩阵。最近，Alemu等人将微生物主成分与宿主基因组信息结合在神经网络基因组最佳线性无偏预测模型中。对于甲烷排放，精度在训练-测试评估中从0.09提高到0.30，在五折交叉验证中从0.15提高到0.27。改进依赖于性状，且未确立在气候胁迫下的性能。一个单独的挑战是区分预测依赖性与生物学中介作用。基因组、微生物和代谢特征是相关的，模型应考虑这种依赖性。纵向采样和定向干预对于加强因果推断是必要的。
9. 气候智慧型绵羊的预测建模
气候智慧型绵羊生产的预测框架应整合生物学和环境信息，以识别具有低甲烷排放、高饲料效率和改善的气候胁迫适应性的动物，使用可在群体规模收集的测量数据。基于当前证据，主要输入类别包括宿主基因组信息、瘤胃微生物图谱、靶向代谢组学测量、生产和甲烷相关表型，以及描述热负荷、日粮和饲料可用性的环境变量。一个有效的建模框架理想情况下应结合可解释的统计方法与灵活的预测方法。基于混合模型的方法可给出方差组分和育种值估计。机器学习方法可以建模非线性互作，但其益处取决于性状、样本量和验证设计。这些灵活方法可能过拟合。环境变量应显式构建到这些模型中，以估计基因型-环境互作，而非将环境变异视为未解释的噪声。验证仍是实际应用的主要障碍。模型需在测量平台、日粮、品种和气候环境中进行测试。在同一群体内的随机交叉验证应与在后续队列中的前瞻性评估以及在独立品种或地区的外部验证相区分。
10. 方法论挑战
甲烷相关性状的解读在很大程度上取决于所使用的测量方法，不同方法以不同的准确性、通量和环境相关性捕获表型。呼吸室仍是参考标准，但成本高、通量有限且可能影响动物行为。六氟化硫示踪技术允许在更自然的放牧条件下测量甲烷排放。便携式累积室在准确性、成本和通量之间提供了实用平衡，因此广泛用于遗传评估。然而，PAC和呼吸室的甲烷测量仅具有约0.62至0.67的适中遗传相关。斑点采样系统如GreenFeed已在牛中更广泛使用。鉴于直接测量的局限性，间接指标正受到越来越多的关注。采样设计和分析决策也塑造了下游的生物学解释。日粮是瘤胃微生物群落组成最强的决定因素之一。采食后时间和采样时间也必须考虑。品种效应可能也很重要，但大多数绵羊多组学数据集来自有限的研究群体。在分子层面，测序深度和分析策略影响哪些微生物信号能被检测到。代谢组学发现同样受分析平台影响。
11. 未来研究框架
解决当前知识空白需要一个超越单一群落、横断面研究的框架，转向能够捕捉跨环境和生产系统变异的纵向和多品种设计。设计应纳入前瞻性队列，代表对比鲜明的品种和生产系统。气候胁迫暴露应作为定义好的实验因素纳入。表型测定和采样应结合标准化甲烷测量与采食量、生长、羊毛或奶产量以及饲料效率性状。分子层面应使用SNP芯片或全基因组测序评估宿主基因组变异，使用可扩展方法生成瘤胃微生物图谱。分析和验证应将可解释的混合模型与机器学习方法相结合，环境变量应显式纳入以估计基因型-环境效应。模型应经历前瞻性验证和外部验证。最后，候选微生物和代谢生物标志物应进行功能验证，以区分生物学机制与统计关联。
12. 结论
绵羊的甲烷性状具有遗传力和可重复性，支持针对低排放的选择性育种。结合宿主基因组、瘤胃微生物和代谢组信息已在预测方面产生初步改进。更大规模的微生物组研究和新兴神经网络模型提供了预测价值的额外证据，但其结果并未确立跨品种、日粮和气候条件的可靠性能。低甲烷产量、饲料效率、生产力和适应性仍然是必须共同评估的不同目标。热应激下的证据有限，多组学预测跨环境的稳定性仍未得到充分检验。进展需要纵向、多品种研究，配备标准化表型测定、明确的环境测量以及在预测将实际应用的系统中进行独立验证。候选分类群和代谢物应被描述为关联或潜在预测因子，直到功能和外部验证支持更强的论断。多组学方法应补充直接甲烷测量，后者对于校准和基准测试仍然必不可少。
