《International Journal of Molecular Sciences》：Clinical and Genetic Spectrum of OPN1LW/OPN1MW-Associated Disorders in a Chinese Cohort: Contribution of Long-Read Sequencing
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高度同源的OPN1LW/OPN1MW基因簇给分子诊断带来巨大挑战。研究人员回顾性纳入来自10个无亲缘关系中国家庭的12名男性患者，这些患者临床疑似X连锁视锥细胞视蛋白障碍，且均被确认携带OPN1LW/OPN1MW基因簇中的疾病相关变异或单倍型。研究人员将临床记
高度同源的OPN1LW/OPN1MW基因簇给分子诊断带来巨大挑战。研究人员回顾性纳入来自10个无亲缘关系中国家庭的12名男性患者，这些患者临床疑似X连锁视锥细胞视蛋白障碍，且均被确认携带OPN1LW/OPN1MW基因簇中的疾病相关变异或单倍型。研究人员将临床记录、视网膜影像、电生理检查和可用的眼生物学测量，与短读长测序（short-read sequencing）、Sanger验证、拷贝数分析以及Oxford Nanopore长读长测序（long-read sequencing）结合分析；长读长测序用于3例短读长测序未能完全解析的病例。临床亚组包括蓝锥细胞单色视（blue cone monochromacy, BCM；n = 5）、X连锁锥体细胞营养不良（X-linked cone dystrophy, XLCOD；n = 4）、Bornholm眼病（Bornholm eye disease, BED；n = 2）和孤立性色觉缺陷（color-vision deficiency, CVD；n = 1）。分子结果涵盖序列变异、外显子剂量改变、一个累及基因座控制区（locus control region, LCR）的51.8 kb缺失以及外显子3单倍型。长读长测序定义了一例患者的缺失断裂点以及两例外显子3单倍型。在一名表现为X连锁锥体细胞营养不良的男孩中，双眼平均眼轴长度在1.80至6.24岁期间从25.36 mm增加至28.47 mm。研究结果表明多模式分子检测具有互补效用，并揭示了视锥细胞视蛋白障碍的表型异质性；儿童期持续性眼轴伸长仅为单病例观察。
人类三色视觉依赖短波、中波和长波敏感视锥细胞视蛋白。OPN1SW位于7号染色体，而OPN1LW和OPN1MW在Xq28形成串联基因簇，通常包含一个上游OPN1LW和一个或多个OPN1MW拷贝，其表达受上游基因座控制区（locus control region, LCR）调控。该区段高度同源，易发生不等交换、基因转换、外显子交换、拷贝数变异、杂合基因（hybrid gene）和结构重排；相关疾病包括红绿色觉缺陷、蓝锥细胞单色视（BCM）、X连锁锥体细胞营养不良（XLCOD）、Bornholm眼病（BED）、视锥细胞或视锥-视杆细胞营养不良以及早发性高度近视。短读长测序（short-read sequencing）虽可发现序列水平变异，但常无法解析该重复基因座的基因顺序、拷贝数、杂合基因和LCR状态；长读长测序（long-read sequencing）可跨越同源区段，有助于明确致病性基因阵列结构。研究人员联合应用下一代测序、Sanger验证、家系分离分析和Oxford Nanopore测序，结合视网膜影像、电生理和儿童眼生物学测量，对来自10个无亲缘关系中国家庭的12例男性患者进行整合分析，旨在评估长读长测序的贡献并描述视锥细胞视蛋白障碍的临床多样性。研究发现该疾病临床表型高度异质，长读长测序对LCR缺失断裂点及外显子3单倍型解析具有补充价值，并提示整合分子检测和早期眼生长监测在临床中的意义。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：研究队列来自北京协和医院眼科2013至2026年收治的12名男性患者，来自10个无亲缘关系的中国家庭。方法包括全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）、三人全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）、Sanger测序验证、多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）和定量PCR（quantitative PCR, qPCR）拷贝数分析；对3例短读长测序未完全解析的病例及2名父亲共5人进行Oxford Nanopore长读长测序。临床评估涵盖视力、屈光、眼轴长度、眼底照相、眼底自身荧光（fundus autofluorescence, FAF）、光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）、色觉检查和全视野视网膜电图（full-field electroretinography, ffERG）。
2.1 临床发现与表型谱（Clinical Findings and Phenotypic Spectrum）
12例患者来自10个无亲缘关系的非近亲中国家庭，首诊年龄1至78岁，记录小数视力0.01至约0.90。临床分组为BCM（n = 5）、XLCOD（n = 4）、BED（n = 2）和色觉缺陷（CVD；n = 1）。常见眼底表现为豹纹状眼底、视盘倾斜和局灶性椭圆体区/交界面带（EZ/IZ）异常。
2.1.1 蓝锥细胞单色视（Blue Cone Monochromacy）
共5例患者。F1-1视锥细胞反应几乎熄灭或严重降低，视杆细胞反应中度降低。Family F2三名受累成员携带相同OPN1LW c.161dup变异，但表现明显家族内变异；祖父F2-3有黄斑萎缩、弥漫性视网膜变薄和外层视网膜破坏，视杆反应严重降低，明视反应熄灭，S-视锥细胞反应可识别但波幅降低。F3-1为严重BCM，存在包含LCR的缺失，暗适应反应可记录，而明视3.0和30 Hz反应几乎熄灭。
2.1.2 X连锁锥体细胞营养不良（X-Linked Cone Dystrophy）
共4例，屈光、视网膜结构和ERG表现差异较大。F4-1明视反应显著降低或近熄灭；F5-1暗适应反应大致保留，明视和30 Hz反应中度降低；F6-1为伴严重早发近视的XLCOD，视锥细胞反应显著降低，眼轴持续增长；F7-1结构改变较轻，视锥反应降低，S-视锥细胞记录因通道标签不一致和方案记录不全而无法得出功能正常结论。
2.1.3 Bornholm眼病（Bornholm Eye Disease）
F8-1和F9-1均有高度近视、红绿色觉缺陷、中心凹EZ/IZ破坏、暗适应ERG反应正常，明视反应轻至中度降低。F9-1存在后巩膜葡萄肿和后极部广泛低自身荧光，视杆介导功能相对保留。
2.1.4 色觉缺陷（Color Vision Deficiency）
F10-1为本组唯一患者，78岁，视力0.4，假同色板检测部分失败并呈红绿色觉缺陷，OCT显示局灶中心凹IZ破坏，存在白内障；因未记录全视野ERG，该描述性分类不能确立视锥功能正常。
2.2 眼轴长度与纵向变化（Axial Length and Longitudinal Change）
可分析的眼轴数据来自8/12例患者，范围23.68至28.55 mm。F6-1在1.80至6.24岁期间双眼平均眼轴从25.36 mm增至28.47 mm，末次与首次差值约3.11 mm，历时1624天（约4.45年），粗略估算约0.70 mm/年，该数值为描述性首末次估计而非回归。持续性眼轴伸长仅作为F6-1个体发现报告；其他患者纵向数据不足以形成队列水平结论。
2.3 遗传发现（Genetic Findings）
共确认5个序列变异，全部经OPN1LW特异性扩增子的Sanger测序验证。OPN1LW c.1A>C（p.Met1?）评估了起始密码子下游+55 bp处的ATG；由此启动翻译将导致移码并在42个氨基酸后出现提前终止密码子，不能产生功能性全长蛋白。Family F2共享c.161dup。p.(Trp51Arg)为意义未明变异（VUS），计算预测结果不一致。p.(Pro187Ser)结合已发表功能证据支持可能致病。F7-1的MLPA显示OPN1LW外显子3至5剂量降低、OPN1MW拷贝数增加，提示可能存在杂合基因；F10-1的qPCR未检测到OPN1LW外显子2、4和5的L特异性信号，其女儿约为对照剂量的一半。F3-1的缺失未在ACMG/ClinGen CNV框架下正式分类。
2.4 外显子3单倍型与结构变异的长读长分析（Long-Read Analysis of Exon 3 Haplotypes and Structural Variation）
在F3-1、F8-1和F9-1中，短读长测序未能确立分子诊断，遂对5人进行Oxford Nanopore测序。短读长在高度同源区域存在特征性覆盖缺失：所有样本中OPN1LW外显子3和OPN1MW外显子1、3、4达到≥20×唯一比对深度的碱基比例为0.00%，而该基因簇外对照区域不受影响，说明覆盖损失特异地源于L/M视蛋白基因高度同源。F8-1携带OPN1LW-LVAVA和OPN1MW-MVAVA单倍型；F9-1携带OPN1LW-LIAVA和OPN1MW-MVVVA单倍型。F3-1经长读长测序鉴定出约51.8 kb的母源性LCR缺失chrX:g.154127837_154179624del（hg38），整个LCR和OPN1LW被删除，而OPN1MW及下游序列保留；断点两侧存在9 bp微同源序列（AAGACACAA），支持微同源介导的末端连接（MMEJ）作为可能机制。
讨论部分指出，既往研究已描述OPN1LW/OPN1MW相关疾病的广泛临床谱；整合分子与眼科评估显示BCM、XLCOD和BED之间存在临床重叠，仅凭临床表现难以区分轻症病例，分子确诊是分类基础。长读长测序对含LCR缺失等复杂结构变异尤其有价值。Family F2的c.161dup在同一家系中出现显著代际差异，提示年龄相关进展可能参与，但该横断面比较不能预测个体退化速率。F6-1的连续眼轴测量显示早期眼生长破坏，但无法区分出生前差异与出生后快速伸长；角膜和晶状体屈光力未系统评估，脉络膜厚度和巩膜生物力学也未测量。外显子3单倍型如LIAVA和LVAVA在文献中与高度近视和红色觉异常相关，但本研究中F8-1和F9-1的红绿色觉缺陷未完全亚型分析，完整基因阵列结构亦未确立。小样本回顾性设计、非统一随访、S-视锥细胞方案记录不全、拷贝特异性贡献未解析以及长读长测序仅在常规检测未解决时使用所致的选择偏倚限制推断。研究结论可翻译为：这些发现支持综合分子评估和早期眼生长监测，但并未为所有视锥细胞视蛋白障碍确立单一机制；未来研究应结合早期标准化眼生物学测量、色觉测试、ERG、OCT/FAF和定相基因阵列分析，并进行多位点交互分析以区分视蛋白效应与其他近视易感位点。
