基于适配体CAR-T平台RevCAR靶向宫颈癌细胞的免疫治疗研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Immunotargeting of Cervical Cancer Cells with the Adaptor CAR T-Cell Platform RevCAR

　　

前列腺干细胞抗原（PSCA）不仅在前列腺癌（PC）中过表达，也在包括宫颈癌（CC）在内的许多其他肿瘤中过表达。适配体嵌合抗原受体（CAR）平台RevCAR可用于靶向表达PSCA的肿瘤细胞。研究人员发现宫颈癌细胞系SiHa天然表达PSCA，其表达水平足以利用近期描述的针对PSCA的RevCAR靶向模块（RevTM）重定向RevCAR T细胞。然而，与几乎所有前列腺癌细胞系相似，SiHa细胞在体外培养过程中也会下调PSCA的表达。为克服这一限制，研究人员建立了人工过表达PSCA的SiHa细胞。RevCAR T细胞的重定向严格依赖于PSCA导向的RevTM和表达PSCA的靶细胞，这导致：（i）CD69、穿孔素（Perforin）和颗粒酶B（Granzyme B）的上调；（ii）靶细胞裂解，半数效应浓度（EC50）达到皮摩尔级别；（iii）分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-2（IL-2）。表型分析显示，记忆性RevCAR T细胞显著增加，而耗竭性细胞仅有轻微增加，表明RevCAR T细胞的基础信号水平较低。总之，这些数据支持利用RevCAR技术对表达PSCA的宫颈癌细胞进行高效且安全的免疫靶向。

研究背景与问题

宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一，2024年预计造成约28万例死亡。高危型人乳头瘤病毒的持续感染是疾病发展的关键因素。尽管筛查和预防手段有所进步，但晚期或复发性患者的临床预后仍然很差，传统治疗效果有限，亟需新型疗法。

嵌合抗原受体T细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了成功，但在实体瘤中效果不佳，主要原因包括：传统CAR T细胞存在基础信号传导，导致抗肿瘤效力差、存活率降低及耗竭；缺乏理想靶抗原，易引发“脱靶-肿瘤外”毒性；实体瘤免疫抑制微环境阻碍免疫细胞浸润和功能。此外，传统CAR T细胞一旦回输后便无法调控其功能。

为解决上述问题，研究人员开发了适配体CAR平台（如UniCAR和RevCAR）。其中，RevCAR平台通过将CAR基因中的单链可变区替换为小肽表位，并将相应表位替换为RevTM中的单链可变区，从而降低了因胞外单链可变区聚集而导致基础信号传导的风险。RevCAR T细胞可通过间断应用RevTM实现功能开关控制，并能通过“OR门控”和“AND门控”策略提高肿瘤特异性。

研究目的与意义

本研究旨在首次建立利用RevCAR系统对宫颈癌细胞进行单一免疫靶向的方法。研究人员选择前列腺干细胞抗原作为靶点，因为PSCA不仅在多种实体瘤中过表达，而且在宫颈癌组织中也存在高表达。此前，研究人员已开发出针对PSCA的单链可变区结构域，并在双特异性T细胞衔接分子临床试验中验证了其安全性和有效性。因此，本研究评估了基于该抗PSCA结构域的新型RevTM在重定向RevCAR T细胞杀伤PSCA阳性宫颈癌细胞方面的潜力。

主要关键技术方法

1. 1.
   细胞模型建立：利用慢病毒转导，在宫颈癌细胞系SiHa中稳定过表达PSCA和萤火虫荧光素酶报告基因，建立可靠的PSCA阳性宫颈癌细胞模型SiHa-PSCA⁺-Luc⁺。
2. 2.
   RevTM设计与生产：采用两种形式的PSCA RevTM——单链可变区基和IgG4骨架基，由稳定转染的3T3细胞系表达并通过亲和层析纯化。
3. 3.
   T细胞制备与RevCAR修饰：从健康供者外周血单个核细胞中分离T细胞，经活化后用编码RevCAR-E5B9的慢病毒载体转导，获得RevCAR T细胞。
4. 4.
   功能检测：通过流式细胞术评估RevTM与靶细胞和效应细胞的结合能力；采用基于荧光素酶的细胞毒性实验测定杀伤效率及半数效应浓度；使用ELISA检测细胞因子分泌；通过流式细胞术分析激活标志物、细胞内效应分子及表型分化。

研究结果

2.1 PSCA RevTM的表达与表征

成功生产并纯化了两种PSCA RevTM。还原条件下，PSCA-IgG4 RevTM约为85 kDa，PSCA-scFv RevTM约为55 kDa，纯度满足临床前功能研究需求。

2.2 PSCA RevTM的双特异性结合

两种PSCA RevTM均能高效结合SiHa-PSCA⁺-Luc⁺细胞（结合率分别为91%和95%），平衡解离常数约为8–9 nM，同时也能识别RevCAR T细胞上的E5B9表位，证实了其高亲和力和特异性双价结合能力。

2.3 RevCAR T细胞的体外细胞毒性

在PSCA RevTM存在下，RevCAR T细胞可快速、高效地裂解SiHa-PSCA⁺-Luc⁺细胞：8小时即达约50%裂解，16小时超过90%。剂量反应分析显示半数效应浓度值处于皮摩尔范围（scFv型为13.6 pM，IgG4型为22.2 pM）。即使在低效靶比（如1:1）下仍能观察到显著的肿瘤细胞裂解。对照实验证实，无RevTM或使用非特异性RevTM时杀伤活性极低，表明该过程严格依赖抗原。

2.4 促炎性细胞因子分泌

在PSCA RevTM介导的重定向作用下，RevCAR T细胞显著分泌GM-CSF、TNF-α、IL-2和IFN-γ，而在无RevTM条件下细胞因子水平很低或检测不到，进一步证明了系统的开关依赖性。

2.5 抗原依赖性激活与细胞毒性效应表型

共培养16小时后，CD8⁺ RevCAR T细胞中早期激活标志物CD69阳性频率显著升高，同时细胞内颗粒酶B和穿孔素的表达也显著增加，表明RevCAR T细胞获得了功能性细胞毒性效应表型。

2.6 RevCAR T细胞的表型特征

抗原特异性刺激后，效应记忆T细胞比例显著增加，而耗竭相关标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3）的表达水平很低，大多数细胞不表达或仅表达单个耗竭标志物。这一表型模式支持RevCAR基因设计能够降低基础信号传导风险的假设。

讨论与结论

讨论部分指出，RevCAR平台通过外部可调控的RevTM实现了T细胞功能的精确控制，有助于克服传统CAR T细胞面临的抗原异质性、“脱靶-肿瘤外”效应、肿瘤浸润受限及基础信号导致的耗竭等问题。RevCAR基因的小尺寸使其易于构建双RevCAR载体，用于“AND门控”等多特异性靶向策略。PSCA作为靶点的选择基于其在宫颈癌等实体瘤中的广泛过表达，以及相关抗PSCA结构域已在临床试验中验证的安全性。

研究结论：本研究结果表明，RevCAR平台可成功应用于重定向RevCAR T细胞至表达PSCA的宫颈癌细胞，支持了可开关式CAR T细胞策略治疗该肿瘤实体的可行性。通过外部RevTM精确控制T细胞激活，结合抗原依赖性功能反应，凸显了这一方法克服传统CAR T细胞治疗关键局限性并改善其临床应用前景的潜力。