《International Journal of Molecular Sciences》：Kallmann Syndrome and MSI-H Colorectal Cancer in a Patient with a Germline PROKR2 Variant: A Case Report with Exploratory Cohort Analysis
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摘要
PROKR2是已确立的Kallmann综合征（KS）相关基因，临床前研究提示其可能在肿瘤发生中发挥作用。本研究报道一例携带PROKR2变异且合并微卫星不稳定-high（MSI-H）结肠癌的患者，旨在探索PROKR2变异与结直肠癌（CRC）MSI-H状态之
摘要
PROKR2是已确立的Kallmann综合征（KS）相关基因，临床前研究提示其可能在肿瘤发生中发挥作用。本研究报道一例携带PROKR2变异且合并微卫星不稳定-high（MSI-H）结肠癌的患者，旨在探索PROKR2变异与结直肠癌（CRC）MSI-H状态之间的潜在关联。研究人员对先证者及其父母的外周血样本进行全外显子测序（WES）以鉴定胚系变异。WES结果显示，先证者及其父亲均携带KS相关基因PROKR2（NM_144773.4:c.337T>C, p.Tyr113His）的一个可能致病性变异。为将该病例置于更广泛的背景下，研究人员在两个公共CRC队列（DFCI-CRC和TCGA-CRC）中对PROKR2体细胞变异进行了探索性生物信息学分析，尽管这些队列分析无法提示胚系风险。在DFCI-CRC队列中，PROKR2体细胞变异状态与MSI-H状态在未调整分析或TMB调整分析中均无统计学显著关联。在TCGA-CRC队列中，PROKR2体细胞变异与较高的未调整MSI-H比值比相关（OR = 5.50，95% CI = 1.003–30.20，p = 0.0248，BH校正q = 0.0495）。经TMB调整后，这一正相关不再保留，且调整后估计值方向相反（调整后OR = 0.093，95% CI = 0.014–0.549，p = 0.00875，BH校正q = 0.0175）。因此，本病例报告描述了一名患者同时出现PROKR2相关KS和MSI-H CRC，但PROKR2相关KS与CRC之间的因果关系尚未确立。
PROKR2胚系变异与Kallmann综合征及MSI-H结直肠癌的共现：病例报告与探索性队列分析解读
一、研究背景与目的
PROKR2属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，具有细胞外N端、细胞内C端及七个跨膜α螺旋结构，与PROKR1高度同源，两者均结合配体PROK1和PROK2，在不同组织中表现出组织特异性的生物学活性和表达调控差异。PROKR2在侧脑室室下区和嗅球高表达，这两个区域是神经前体细胞的来源。PROKR2胚系变异可影响促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的发育和迁移，导致伴有嗅觉缺失的特发性低促性腺激素性性腺功能减退症（IHH），即Kallmann综合征（KS），或嗅觉正常的IHH（nIHH）。PROKR2作为GPCR，在配体结合后介导钙离子和cAMP等细胞内信号通路。prokineticin系统参与神经元存活、痛觉感知、胃肠平滑肌收缩、血管生成及血管通透性调节等多种生理过程，其配体PROK1又称内分泌腺来源的血管内皮生长因子（EG-VEGF），可促进内分泌组织血管生成。这些观察促使研究者进一步探索PROKR2在肿瘤发生中的潜在作用。在结直肠癌（CRC）中，有研究报道PROKR2免疫组化阳性染色与血管侵犯、淋巴结转移、肝转移和血行转移风险增加相关，提示其可能作为CRC的预后标志物。另有基于CRC和腺瘤的多组学分析报道，PROKR2胚系SNP rs6085078与队列中高CRC风险相关。然而，PROKR2变异导致的KS这一内分泌疾病与CRC发生之间的潜在关系尚不明确。本研究报道一例携带PROKR2可能致病性胚系变异、同时患有KS和微卫星不稳定-high（MSI-H）结肠癌的中国患者，并基于该病例开展公共CRC队列的探索性分析，以检验PROKR2体细胞变异与MSI-H状态及临床结局的关联。
二、研究内容与结论
研究人员报道了一例26岁中国男性患者，2023年因反复腹痛和腹泻就诊，胃肠内镜发现升结肠巨大肿块，行腹腔镜部分结肠切除术及淋巴结清扫。术后病理示中低分化腺癌伴黏液成分，侵犯浆膜下层，区域淋巴结转移1/58，术前CT未见远处转移，病理分期为pT3N1aM0。免疫组化显示肿瘤MSH2和MSH6表达缺失，MLH1和PMS2表达保留。分子检测检出KRAS G13D突变和TP53移码变异（p.Arg47fsTer76），确认MSI-H状态，MSH2和MSH6未检出体细胞变异。患者18岁时临床诊断为KS，存在嗅球和嗅束发育不全，曾接受人绒毛膜促性腺激素（HCG）治疗但因体重增加而停用。激素检测显示促黄体生成素（LH）、孕酮和睾酮水平降低，符合持续性性腺功能减退。患者于2023年接受XELOX辅助化疗一周期后因肝功能异常改为mFOLFOX6方案共11周期，随访至2026年10月未见复发或转移。家系中父亲有轻度嗅觉障碍和直肠神经内分泌肿瘤病史，姑姑有乳腺癌病史，祖父有胃癌病史。研究人员对先证者及其父母进行全外显子测序（WES），分析30个遗传性癌症易感基因和58个先天性低促性腺激素性性腺功能减退（CHH）相关基因。初步解读未在评估基因中检出致病性或可能致病性变异，所有意义不明确变异（VUS）均被汇总。WES拷贝数变异（CNV）分析未发现MSH2、MSH6和EPCAM的明显异常或大片段缺失，因此未建立Lynch综合征（LS）的分子诊断。进一步评估CHH相关变异并结合遗传模式和临床表型，优先考虑两个杂合错义变异进行重新评估：PROKR2（NM_144773.4:c.337T>C; p.Tyr113His）和ARHGAP35（NM_004491.4:c.3616C>G; p.Pro1206Ala）。两个变异均见于先证者及其父亲，母亲未检出。Sanger测序确认PROKR2变异的家系分布，并在先证者姐姐中检出。依据ACMG/AMP框架结合家系共分离证据和已发表证据，PROKR2变异被重新分类为可能致病性，ARHGAP35变异因证据不足仍为VUS。结合临床表型，这些发现支持PROKR2相关KS的诊断。
为探究PROKR2变异与MSI-H状态的相关性及预后意义，研究人员对两个公共CRC队列DFCI-CRC和TCGA-CRC进行生物信息学分析。本家系检出的PROKR2胚系p.Tyr113His变异未在公共CRC队列中作为体细胞变异观察到。DFCI-CRC队列619例CRC患者中11例携带PROKR2变异。在529例有MSI状态数据的患者中，携带PROKR2体细胞变异者（n=9）较野生型（WT）者（n=520）有更高的MSI-H比值比（OR = 3.97，95%CI 0.77–18.83，p = 0.0517，BH校正q = 0.0517），但经肿瘤突变负荷（TMB）调整后该关联不再保留（调整后OR = 0.52，95% CI = 0.056–6.71；p = 0.592）。两组间TMB秩分布差异显著（Wilcoxon秩和检验p = 0.0060），PROKR2变异组观察到的中位TMB较高，但95% bootstrap CI包含零，估计不精确。TCGA-CRC队列526例患者中8例携带共10个PROKR2变异。未调整分析显示PROKR2体细胞变异者更可能为MSI-H（OR = 5.50，95%CI 1.003–30.20，p = 0.0248，BH校正q = 0.0495），但经TMB调整后方向反转（调整后OR = 0.093，95% CI = 0.014–0.549；p = 0.00875；BH校正q = 0.0175）。PROKR2变异组TMB显著更高（中位差83.38突变/Mb，95% bootstrap CI 33.00–207.83，p = 8.29×10?6）。肿瘤亚型分布组间差异显著，PROKR2变异组MSI和POLE突变亚型比例更高（Cramér's V = 0.487，p = 5×10?6）。为排除高突变肿瘤中乘客突变的影响，研究人员将PROKR2与20个编码长度相似且WT表达水平匹配的基因比较，结果显示该TMB差异并非PROKR2特有。基因集富集分析（GSEA）显示Watanabe和Koinuma MSI-up特征向PROKR2变异端富集，MSI-down特征向WT端富集，但经MSI状态、log10TMB和POLE变异状态联合调整后，四个MSI特征均不再显著。在TCGA-CRC MSI-H亚组中（4例PROKR2变异和79例WT），PROKR2变异者总生存期（OS）和疾病特异性生存期（DSS）较短（OS HR = 4.22，95%CI 0.91–19.55，p = 0.045；DSS HR = 5.57，95%CI 1.16–26.84，p = 0.016），但BH校正后均不显著。无进展间期（PFI）组间无显著差异。
三、主要技术方法
研究人员对先证者及其父母外周血样本提取基因组DNA后进行全外显子测序（WES），使用Agilent SureSelect Human All Exon V7捕获外显子区域，以hg19为参考基因组，通过GATK4工具检测变异，ANNOVAR进行注释，IGV软件可视化PROKR2 p.Tyr113His位点蛋白突变状态，maftools工具进行变异可视化分析。Sanger测序用于验证PROKR2 c.337T>C变异。队列分析选用两个公共CRC队列：DFCI-CRC（Colorectal Adenocarcinoma，DFCI，Cell Reports 2016）和TCGA-CRC（Colorectal Adenocarcinoma，TCGA，PanCancer Atlas），体细胞变异状态以cBioPortal PanCancer Atlas MC3 callset定义，MSI状态在DFCI-CRC中采用cBioPortal临床注释（MSI-H或MSS），在TCGA-CRC中采用MSI-MANTIS评分（≥0.4定义为MSI-H）。统计分析采用Fisher精确检验比较MSI-H比例，Wilcoxon秩和检验比较TMB分布，Firth逻辑回归进行TMB调整分析，Firth惩罚Cox模型进行稀疏数据敏感性分析。RNA-seq数据从GDC下载TCGA-COAD和TCGA-READ原始count数据，合并后排除正常组织样本，通过limma-voom进行差异表达分析，fgseaMultilevel进行预排序基因集富集分析（GSEA），使用MSigDB人类C2集合。
四、讨论与结论
MSI源于错配修复（MMR）缺陷，约15%的CRC表现为MSI-H，可由MLH1表观沉默、MMR基因胚系突变或EPCAM缺失、或双等位体细胞MMR突变引起。本研究中WES未检出MMR基因致病性或可能致病性胚系变异，但WES可能遗漏某些拷贝数变化、复杂结构重排和深部内含子或调控区变异，因此建议进一步行多重连接探针扩增（MLPA）评估MSH2和EPCAM缺失或重复，以及长读长基因组测序。肿瘤MSI-H表型最可能由WES未检出的MMR改变所致。鉴于患者早发CRC、癌症家族史和无法解释的MSH2/MSH6缺失，发现仍提示Lynch样综合征，需密切临床随访和结肠镜监测。PROKR2 p.Tyr113His变异的功能证据包括Cole等人报道的杂合女性KS患者中受体表达降低和下游信号受损，以及Ha等人报道的杂合男性KS患者。然而杂合PROKR2变异的临床表现可变，已有临床未受累携带者报道，提示不完全外显率。本家系中先证者表现为典型KS，父亲仅轻度嗅觉减退，携带者姐姐无典型KS表型。ARHGAP35杂合变异虽有KS或nIHH患者报道及斑马鱼模型和功能实验支持，但p.Pro1206Ala无变异特异性功能证据，仍为VUS。TFR2相关血色病为常染色体隐性遗传病，单个杂合变异不足以诊断。KS中已有寡基因遗传的报道，但本家系中ARHGAP35和TFR2变异的共现尚不能确立寡基因解释。KS是否与CRC风险增加或降低相关仍不清楚，直接临床证据有限。有会议摘要报道未接受激素替代治疗（HRT）的≥50岁KS女性CRC风险低于无KS匹配队列，但该摘要存在样本量和统计结果内部不一致，结论需谨慎解读。动物实验和流行病学研究提示卵巢切除增加大鼠肿瘤形成和MSI阳性肿瘤比例，既往HRT使用与女性MSI阳性结肠癌风险增加相关；男性前列腺癌患者接受睾丸切除或雄激素剥夺治疗（ADT）后CRC风险增加，但均未评估肿瘤MSI状态。本病例中先证者KS相关性激素缺乏可能与其CRC相关，但共现不能确立因果关系。肿瘤组织局部PROK1（EG-VEGF）-PROKR2信号的可能贡献也值得考虑。先证者2023年诊断III期dMMR结肠癌，接受根治性切除和辅助氟嘧啶-奥沙利铂双药化疗。2025年ASCO年会公布的ATOMIC试验结果显示辅助mFOLFOX6联合atezolizumab较单用mFOLFOX6改善无病生存期，2025年NCCN指南首次将FOLFOX或CAPEOX联合atezolizumab列为切除后III期dMMR/MSI-H结肠癌患者的首选辅助治疗选项。欧洲内分泌学会指南指出，受控的内分泌病变不是启动或继续免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的禁忌。若考虑ICI治疗，需肿瘤科与内分泌科协作管理，基线评估应记录性腺功能障碍并评估肾上腺和甲状腺功能，定期监测以区分新发内分泌毒性与既有状况。本研究局限性包括：部分结果样本量较小；胚系PROKR2变异与MSI-H CRC易感性之间的关联未经实验验证；高突变和MSI状态为潜在混杂因素；缺乏肿瘤PROKR2测序和杂合性缺失评估。总之，本研究报告一例携带PROKR2可能致病性胚系变异（NM_144773.4: c.337T>C, p.Tyr113His）的PROKR2相关KS患者发生MSI-H结肠癌。公共CRC队列探索性分析提示肿瘤PROKR2变异与MSI-H状态存在关联，且小样本MSI-H亚组中变异携带者生存较差。这些发现为假设生成性质，不能确立PROKR2相关KS或相关性腺功能减退增加CRC风险或促成MSI-H状态，需在更大队列中验证并进行机制研究以阐明这些关系。
