《International Journal of Molecular Sciences》：Genome Editing for Earliness and Plant Architecture in Cucurbit Crops: Recent Advances and Future Perspectives
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摘要：早熟性和株型结构是瓜类作物育种的主要目标，因为它们影响作物生育期、早期产量、种植密度、冠层管理和生产效率。本综述总结了与黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜属物种及其他瓜类作物在开花、性别表达、果实发育、茎伸长、分枝和冠层结构相关的遗传学、分子生物学和基因组编辑方面的
摘要：早熟性和株型结构是瓜类作物育种的主要目标，因为它们影响作物生育期、早期产量、种植密度、冠层管理和生产效率。本综述总结了与黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜属物种及其他瓜类作物在开花、性别表达、果实发育、茎伸长、分枝和冠层结构相关的遗传学、分子生物学和基因组编辑方面的研究进展。现有证据表明，提早开花或增加雌花比例并不必然导致更早的商业成熟度，而紧凑型生长必须结合产量、果实品质和环境适应性进行综合评估。CRISPR/Cas9敲除仍是最成熟的编辑方法，而碱基编辑（base editing）、顺式调控区编辑（cis-regulatory editing）、多重编辑（multiplex editing）、发育调节因子辅助再生（developmental-regulator-assisted regeneration）以及无DNA的核糖核蛋白递送（DNA-free RNP delivery）为实现更精准的性状优化提供了有前景的途径。主要制约因素包括基因型依赖性的转化效率、多效性效应、在优良种质中验证有限，以及缺乏缩短果实发育周期的直接证据。研究人员提出了一种基于证据的框架，将性状定义、功能基因组学、靶点优先级排序、定制化基因组编辑、全株评估和育种应用相衔接。未来的进展将依赖于定量化调控等位基因的开发，以及对生殖时序、冠层结构、生产力、果实品质和环境稳定性的协同优化。
1. 引言
瓜类作物（黄瓜Cucumis sativus、甜瓜Cucumis melo、西瓜Citrullus lanatus、南瓜属Cucurbita spp.及其他相关瓜类）在日益集约化的生产系统中栽培。早熟性在保护地栽培、早春露地生产和多茬种植系统中具有重要的经济价值，也是缩短世代周期的重要育种目标。然而，这些位点的表型效应常随发育阶段和环境条件而变化。株型结构决定了瓜类冠层如何有效利用空间并将截获的光能转化为可销售的产量。关键株型性状包括蔓长、节间长度、分枝模式、叶柄角度和茎端有限生长性。自然调控变异及基因组编辑的紧凑冠层模块表明，冠层结构可以有目的地改良。早熟性与株型结构在发育上是相互关联的，其协调涉及茎尖分生组织命运、成花转变、性别决定、激素信号、分枝、节间伸长和源库关系。因此，育种的挑战并非简单地缩短生育周期或减小植株尺寸，而是需在不损害育性、产量、果实品质和环境稳定性的前提下，协同优化发育时序和冠层结构。
2. 瓜类作物的基因组编辑平台
2.1 CRISPR/Cas9与无转基因编辑：CRISPR/Cas9仍是瓜类作物中最广泛使用的基因组编辑平台。通过分离编辑构建体可获得无转基因后代，但该方法无法消除再生本身带来的基因型依赖性和组织培养负担。
2.2 转化与再生：编辑植物的获得而非引导RNA设计，仍是大多数瓜类作物的主要实际限制。常规农杆菌介导的转化具有强烈的基因型依赖性。发育调节因子为提高再生效率提供了补充途径，但编辑效率不能等同于育种效率。
2.3 多重编辑：Pol II驱动的sgRNA/Csy4系统提高了甜瓜和西瓜的编辑效率，并能在配对靶点间产生大片段缺失。对于理想株型育种，多重编辑的价值在于组合不同通路的适当调节型等位基因，而非简单叠加严重的无效突变。
2.4 精准编辑：胞嘧啶碱基编辑已在甜瓜中得到验证，可用于重现有利的自然等位基因。腺嘌呤碱基编辑和先导编辑（prime editing）应被视为新兴策略。DNA-free递送可避免稳定的外源DNA整合，但不能消除遗传嵌合现象。
2.5 调控区与无DNA编辑：调控区编辑对剂量敏感的发育基因特别有吸引力。YABBY1的Bush位点提供了直接例子：编辑保守的5'UTR区域可产生分级变化的茎长。预组装的CRISPR/Cas核糖核蛋白可避免稳定的外源DNA整合，甜瓜中通过粒子轰击Cas9 RNP进入茎尖分生组织已产生可遗传的编辑。
3. 早熟性的遗传基础
3.1 开花与分生组织调控：瓜类作物的成花转变由已知的开花和分生组织调节因子的同源物控制。PEBP家族基因位于开花时间和茎端有限生长性的交叉点。光温响应通路与保护地栽培育种相关，但需在不同环境下测试编辑等位基因。
3.2 性别决定与雌花分化：性别决定是生殖早熟性的重要组成部分。乙烯是调控瓜类性别决定的最主要激素通路。生长素也参与性别决定网络。这些研究表明乙烯为中心的调控在瓜类中广泛保守，但具体基因、花表型和育种后果存在物种差异。
3.3 雌花着生位置与容量：雌花时序、节位和频率决定了潜在坐果部位的可用时间。短节间会降低每个节点的物理高度，但不一定减少第一雌花出现的节点数，因此需通过测量第一雌花节位或时间确认早熟性。
3.4 坐果与成熟度：早开花不一定带来早产，因为坐果和后续果实发育是独立阶段。从开花到收获的间隔受多个过程影响，基因组编辑研究应区分坐果、早期果实生长、商业成熟度、生理成熟度和货架期。
3.5 定位至可编辑靶点：早熟性是复杂的数量性状。最强的Level I证据包括直接编辑ClTFL1-ClGRF模块、ClPID用于开花相关表型，以及CsWIP1、ClWIP1、ACS1G和CsARF3用于性别表达。
4. 早熟性的基因组编辑
4.1 开花与分生组织编辑：西瓜中CRISPR/Cas9敲除ClTFL1导致提早开花和侧枝减少，同时编辑ClGRF8或ClGRF12也促进提早开花并减少侧枝。完全功能丧失等位基因可能不适用于培育优良品种。
4.2 性别决定编辑：CRISPR/Cas9破坏CsWIP1产生非转基因的全雌性黄瓜植株，但产生更多雌花并不必然意味着更早的商业成熟度。西瓜中编辑ClWIP1同样产生全雌性植株。其他性别决定网络的组分仍处于Level II。
4.3 果实发育与成熟度编辑：甜瓜中无DNA的原位RNP编辑CmACO1减少了乙烯产生并延长了果实货架期，但这是延迟成熟而非提早商业成熟。直接缩短从开花到商业收获时间的基因组编辑证据仍然有限。
4.4 早熟性靶点优先级排序：Level I条目包括ClTFL1/ClGRFs、ClPID、CsWIP1、ClWIP1、ACS1G和CsARF3。成功的基因组编辑本身不足以应用于育种，需评估等位基因强度、稳定遗传、多效性效应和农业表现。
5. 株型结构的遗传调控
5.1 分生组织命运与有限生长性：植物生长习性受茎尖分生组织活性和发育命运的强烈影响。TFL1相关基因可同时影响株型结构和生殖时序。
5.2 茎生长与紧凑性：赤霉素代谢和信号传导在控制节间长度中发挥重要作用。油菜素内酯代谢是紧凑生长的另一重要调控因子。生长素运输和信号传导也贡献于茎伸长。
5.3 分枝与腋芽生长：分枝受多种激素和环境通路控制。育种目的不应是完全消除侧枝，而是减少不必要的营养生长同时保留能贡献开花和产量的分枝。
5.4 叶片与冠层结构：叶角、大小和形状是冠层结构的重要组成部分。紧凑的叶片或冠层表型应在目标种植密度下进行评估。
5.5 卷须与侧生器官发育：卷须是瓜类特有的侧生器官，其发育与分枝、叶片和花的发育密切相关。
5.6 激素整合：赤霉素和油菜素内酯是支持最好的调控节间伸长和矮化的激素通路。生长素、脱落酸和光信号也参与分枝和叶片结构的调控。
6. 株型结构的基因组编辑
6.1 ERECTA编辑与紧凑型结构：ERECTA家族基因是瓜类作物紧凑型株型结构中支持最好的基因组编辑靶点之一。
6.2 YABBY1调控区编辑：YABBY1的Bush位点提供了使用调控区编辑产生不同程度紧凑生长的清晰范例。
6.3 激素关联的紧凑性：基因组编辑直接验证了与激素调控紧凑生长相关的基因。严重矮化可能降低植株活力或生殖表现。
6.4 分生组织与冠层编辑：分生组织相关基因的编辑也可改变株型结构。冠层结构可通过基因组编辑直接修饰。
6.5 分枝与侧生器官编辑：一些基因组编辑基因影响株型结构的多个组分。
6.6 证据与育种准备度：Level I靶点包括ERECTA家族基因、YABBY1顺式调控区、CsHLS1、CsCLV2等。证据等级和育种价值应分开考虑。
7. 整合早熟性与株型结构
早熟性和株型结构通过分生组织命运、分枝、节间伸长、叶片结构和生殖发育紧密相连。激素通路提供了生殖时序和株型结构之间的额外联系。理想的早熟性与株型组合应根据生产系统定义。基因编辑策略应聚焦于多个性状的协同但适度修改。
8. 当前的瓶颈与挑战
转化和植物再生仍是最直接的技术瓶颈。目前对插入缺失介导的功能丧失突变的依赖是第二个主要限制。生物复杂性提出了同等重要的挑战。概念验证突变体必须转化为农业上有用的优良育种品系。
9. 精准基因组编辑与育种的未来方向
未来进展将取决于从功能丧失诱变向等位基因变异精准工程的转变。碱基编辑和先导编辑提供了引入定义核苷酸替换的途径。顺式调控区是特别有吸引力的靶点。
