《International Journal of Molecular Sciences》：Beyond the Neuron: TDP-43 and the Challenge of Pre-Analytical Quality in Platelet Biomarker Development
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TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）的主要病理标志物。然而，尽管经过二十年的深入研究，可靠的外周T
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）的主要病理标志物。然而，尽管经过二十年的深入研究，可靠的外周TDP-43生物标志物仍未建立。研究人员认识到血小板是TDP-43的主要血液储库，这为新的诊断途径开辟了可能性，但也可能揭示潜在的风险。在这篇叙述性综述中，研究人员首先追溯了TDP-43从核RNA结合蛋白到其功能和疾病相关改变超越神经元的分子演变认知。随后，研究人员审视了近期突破性进展，证明TDP-43功能受其细胞环境影响，以及TDP-43如何在血小板中被独特富集。接下来，研究人员论证了前分析变量，如溶血、凝血、冷链失效和生物样本库方案，并非单纯的“噪声”，而是可能扭曲分子完整性的潜在混杂因素，应予以充分考虑。最后，研究人员讨论了围绕血小板TDP-43的生物学和方法学不确定性，并强调标准化处理和系统化的前分析报告如何能够提高可重复性并支持未来的生物标志物验证。更广泛而言，本综述所述的方法学标准可能超越TDP-43，扩展到血小板中存在且同样对前分析变异性敏感的其他疾病相关蛋白。
论文主体内容总结
1. 引言
TDP-43从最初被发现为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）调节因子，到后来被确认为参与剪接调控的关键RNA结合蛋白，再到被鉴定为大多数ALS病例及约半数FTD病例的主要病理蛋白，其病理学意义已得到充分确立。然而，TDP-43向可靠外周生物标志物的转化尚未实现，主要原因是不同生物体液、分析方法和临床队列之间的研究结果不一致。本综述聚焦于血小板源性TDP-43及可能影响其血液基质测量的前分析因素，包括分离血小板、含血小板血浆和名义上的乏血小板血浆。血小板构成TDP-43富集的血液区室，因此血小板回收率、残留血小板含量、活化状态和样本分级分离的差异可能影响测得的TDP-43浓度。本综述整合了分子TDP-43生物学和临床实验室质量管理两个领域，从分子角度引用了TDP-43受细胞环境强烈影响的最新证据，从实验室质量管理角度考察了离心时间、储存温度、溶血、凝血等前分析变量对样本质量和分析物完整性的影响。此外，血小板在止血之外还参与免疫应答、细胞间通讯和全身病理过程的感知，实验研究表明活化血小板可能参与神经退行性相关过程，如阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD）中描述的改变。在ALS中，血小板血清素水平与生存期相关，而散发性ALS患者的血小板TDP-43被报道升高，支持血小板作为疾病相关分子信息可及来源的潜力。
2. 超越神经元：TDP-43不断演变的细胞与外周图景
2.1 经典观点：神经退行性变中的核RNA结合蛋白
TDP-43是一种普遍表达的核蛋白，调控RNA代谢的多个方面，包括剪接、转运、稳定性和翻译。生理条件下，TDP-43主要定位于细胞核，结合数千个RNA靶标以维持细胞稳态。病理条件下，TDP-43错误定位至细胞质并聚集为不可溶性包涵体，这些胞质聚集体被认定为约97% ALS病例和45–50% FTD病例的定义性病理标志。经典观点以神经元为中心，将TDP-43病理视为主要涉及中枢神经系统（CNS）的过程，这一视角主导了近二十年的生物标志物开发，使大多数研究努力集中于脑脊液（CSF）和血浆。
2.2 细胞环境作为TDP-43功能的主要决定因素
近期证据表明，细胞环境与遗传变异和翻译后修饰一起，是TDP-43功能的重要决定因素。?u?njar及其同事使用细胞类型特异性模型，系统比较了神经元和骨骼肌来源细胞系中TDP-43耗竭的转录组和剪接后果。两种细胞系具有不同的基线转录组，其差异在主成分分析中解释了比TDP-43耗竭更多的变异。TDP-43调控的转录本和选择性剪接事件在神经元和肌肉来源的细胞背景之间存在显著差异。TDP-43耗竭改变了经典靶标如聚合酶（DNA指导）δ相互作用蛋白3（Poldip3）和分拣蛋白1（Sort1）的剪接，但两种细胞类型之间共享的转录组和剪接变化比例有限。这些发现表明，神经元模型中获得的观察结果不能必然外推至其他细胞背景，TDP-43表现为背景依赖性调节因子。然而，这些研究在含核细胞系中进行，其结果不能直接外推至无核血小板。
2.3 挑战神经元中心观点：外周TDP-43生物学的证据
过去十年中，累积证据迫使重新评估神经元中心范式。骨骼肌方面，ALS患者的肌内神经束和骨骼肌纤维中检测到磷酸化TDP-43沉积物。免疫细胞方面，ALS患者外周血单个核细胞（PBMCs）表现出疾病相关转录组改变，一项近期研究显示联合蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基α（PRKAR1A）、谷氨酰胺肽环转移酶（QPCT）和跨膜蛋白71（TMEM71）的表达水平可在两个独立PBMC队列中区分ALS患者与健康对照。血小板方面，Luthi-Carter、Buratti及其同事证明，在其研究使用的分级分离条件下，血小板含血浆中检测到的至少95% TDP-43定位于血小板胞质内，乏血小板血浆中TDP-43含量不足血小板富集血浆的5%。这一发现具有深远意义：血液TDP-43测量可能受残留血小板含量的强烈影响，除非血小板回收和样本分级分离得到充分控制。
2.4 临床相关性：外周TDP-43生物学对生物标志物开发的意义
外周血标本因其采样可及性和检测疾病相关分子信号的可能性，为TDP-43生物标志物开发提供了可及基质。血小板因易于采集且富含TDP-43蛋白而特别值得关注，初步研究已报道ALS中血小板TDP-43的疾病相关差异。转录组研究显示血小板在特发性快速眼动睡眠行为障碍（IRBD）和路易体痴呆（DLB）中存在广泛转录组重塑，而帕金森病（PD）和AD中变化最小。直接TDP-43测量方面，不同研究结果各异：早期研究报告血浆磷酸化TDP-43与神经病理学确诊的FTLD-TDP相关，以及ALS患者CSF中总TDP-43浓度升高；An及其同事开发的基于Meso Scale Discovery的电化学发光免疫分析检测到ALS患者血浆和血清中全长TDP-43浓度低于健康对照。近期研究还扩展至TDP-43功能丧失的后果，包括在症状前和症状性C9orf72重复扩增携带者的CSF中检测到隐蔽外显子衍生的HDGF样蛋白2（HDGFL2）肽段，以及基于血清的均相时间分辨荧光（hTR-FRET）检测显示ALS患者中TDP-43功能活性升高。
3. 血小板TDP-43：生物学依据与生物标志物潜力
3.1 血小板生物学及其作为生物标志物来源的新兴角色
血小板是由巨核细胞衍生的无核细胞碎片，直径1–5 μm，含有功能性mRNA、microRNA及分布于胞质、膜、细胞器和储存颗粒中的多种蛋白质。人血小板循环寿命约7–10天。血小板活化涉及形态和表面标志物变化、从既有mRNA进行蛋白质合成以及颗粒内容物释放，这些过程与标本处理相关，因为活化可改变血小板样本的分子组成。血小板已被作为多种病理状态的生物标志物来源进行研究，包括心血管疾病、癌症和感染。在神经疾病领域，血小板与神经元细胞之间存在功能相似性，包括分泌机制和囊泡区室化，为研究神经疾病中血小板分子变化提供了生物学依据。PD、多发性硬化、HD和AD中均报道了血小板相关改变。生物标志物开发中必须区分三种不同的读数：血小板TDP-43蛋白、编码TDP-43的TARDBP基因转录本，以及可能与TDP-43功能相关的下游RNA特征。血小板转录组因缺乏细胞核而无法通过核内从头转录补充，可能提供由巨核细胞来源转录本、血小板年龄和循环环境相互作用塑造的分子记录。血小板蛋白含量高度动态，受颗粒释放、活化诱导分泌、蛋白质合成、快速降解和蛋白水解加工影响，因此基于蛋白的测量可能对前分析变量特别敏感。
3.2 血小板作为TDP-43的主要但前分析脆弱的血液储库
Luthi-Carter及其同事的研究使用分级分离的人血液证明，血小板富集血浆中检测到的大部分TDP-43蛋白来源于血小板胞质。血小板RNA测序检测到TARDBP基因转录本以及众多先前在神经元样和星形胶质细胞样细胞模型中被鉴定为TDP-43调控靶标的转录本。标准血浆制备方案（包括离心步骤和近棕黄层血小板携带）可强烈影响表观血浆TDP-43水平。因此，血浆中升高的TDP-43可能反映可变血小板污染或回收，而非稳定的疾病相关信号。血小板源性细胞外囊泡（EVs）可携带炎症介质和疾病相关蛋白，EV相关TDP-43测量需要评估残留血小板、血小板源性EV贡献和处理过程中的活化。血小板对机械和热应激、离心以及处理延迟敏感，常规血液采集、储存或生物样本库操作可活化或 destabilize 血小板，可能改变其货物（包括TDP-43）的分布。大多数已发表的生物样本库方案未一致记录血小板活化状态和残留血小板含量，使历史数据集难以解释。
4. 前分析应激源作为血小板TDP-43生物标志物分析中的结构性混杂因素
前分析阶段涵盖样本采集、运输、处理和储存，被认为是检测路径中最易出错的环节，可能占实验室错误的70%。对于血小板源性TDP-43测量，三个关键前分析变量需仔细评估：溶血、凝血/离心不充分、以及冷链失效和储存时长。
4.1 溶血
红细胞破裂引入血红蛋白、蛋白酶和氧化物种进入样本。多中心医院环境中溶血率可高达10–15%。溶血可干扰基于抗体的测量并改变循环RNA谱。溶血的严重程度并非二元的，轻度溶血（溶血指数=1）可能不干扰多数细胞因子的准确定量，但效应因分析物和分析平台而异。溶血和血小板活化可能源于相同的采集相关条件，例如静脉通路困难的患者可能在同一次采血中同时经历红细胞破裂和血小板活化。溶血对TDP-43测量的具体影响需要系统表征。
4.2 凝血和离心不充分
凝血形成和非标准化离心可改变血小板回收和样本组成。离心速度和时长的变化可导致不同量的血小板沉淀，造成样本间残留血小板含量的差异。比较两种血浆分离方法的研究显示，直接离心（DC）的中位残留血小板计数为1.0×109/L，而密度梯度离心（DGC）为3.5×109/L，对应残留血小板含量增加3.5倍。抗凝剂选择进一步使问题复杂化：EDTA血浆可富集特定EV亚群包括血小板相关EV，EDTA可增加血小板α颗粒分泌，而柠檬酸钠和ACD产生不同的干扰模式。多组学建议强调明确记录离心方案，许多TDP-43相关研究使用不同样本基质和处理程序，使跨研究比较面临挑战。基于微珠的蛋白质组学方法虽增强低丰度蛋白检测，但可能易受血小板和PBMC携带的系统性偏倚影响。
4.3 冷链失效和储存时长
血小板活化是温度依赖性和时间依赖性的。在4 °C或室温下延长储存均可改变血小板活化和脱颗粒反应。冷储存血小板在21天储存后仍保留对刺激的应答能力，但促凝血血小板形成逐渐增加（第21天达约20%）。An等人直接评估了血浆和血清中TDP-43在重复冻融循环中的稳定性，前两到三次循环对测量浓度影响最小，而第四次循环后在血浆中观察到适度降低，第三次或第四次循环后在血清中观察到降低。法国血栓与止血学会（SFTH）的建议强调可接受的储存和处理间隔取决于分析物、样本基质、温度和预期检测。为提高可重复性，TDP-43生物标志物研究应采用结构化样本记录，如标准前分析编码（SPREC），记录关键生物样本变量并补充冻融历史、储存时长和检测特异性处理信息。
5. 血小板TDP-43的前分析验证与报告：当前空白与未来方向
5.1 定义血小板TDP-43蛋白和RNA读数的前分析稳定性
血小板活化和脱颗粒在储存期间进行性变化，但血小板TDP-43的时间依赖性和温度依赖性稳定性尚未被系统表征。其他血小板相关分子（包括血清素、CD62P/P-选择素和血小板因子4（PF4））的研究表明血小板表型和货物释放受储存条件和温度影响。稳定性应分别评估总TDP-43、全长和磷酸化蛋白形式以及RNA基础读数（包括TARDBP转录本和下游TDP-43响应RNA）。未来研究应在处理时间、温度、储存时长和冻融暴露的受控组合下同时检查血小板相关和细胞外TDP-43。
5.2 血小板TDP-43的疾病相关变异与前分析易感性
疾病相关血小板是否在处理过程中对活化、膜破坏或货物释放具有不同易感性仍属未知。如果患者和对照的血小板对相同处理条件反应不同，则测得的TDP-43差异可能反映生物学变异和差异性前分析敏感性的组合。Arnaldo等人的研究显示血小板转录组谱在不同神经退行性疾病间存在差异，但未确立血小板脆性改变或直接表征TDP-43生物学。未来病例对照研究应将血小板TDP-43测量与血小板计数、回收估计、活化标志物、细胞纯度对照和疾病相关分子谱分析相结合。使用同一采血的配对等分样本，应量化每个诊断组内处理诱导的变化，并将其幅度与常见参考条件下观察到的患者-对照差异进行比较，以确定处理是否可以掩盖、放大或模拟疾病相关信号。
5.3 TDP-43生物标志物研究中缺乏标准化前分析报告
现有TDP-43生物标志物研究在前分析程序报告方面存在显著异质性。采血与处理之间的时间间隔、离心条件、抗凝剂类型、溶血、凝血和残留血小板含量等信息未被一致提供。临床实验室标准协会指南H21-A5为凝血检测血液标本的采集、运输和处理提供建议，但尚未为血液基础或血小板源性TDP-43生物标志物研究制定可比报告指南。基于既有前分析建议和实验室医学框架，本综述提出了血液基础和血小板源性TDP-43研究的最低报告清单。
6. 方法
本叙述性综述综合了通过PubMed、Google Scholar和Web of Science鉴定的文献。最后一次检索于2026年8月进行。主要检索字符串包括TDP-43或TARDBP与血小板或血栓细胞、生物标志物或生物标志物开发、前分析与血小板或血液、溶血与生物标志物或检测、离心或血小板回收与血浆或血清、储存稳定性或冻融与血小板或TDP-43、ALS与外周血生物标志物、FTD与外周血生物标志物的组合。研究根据四项标准优先选择：涉及血小板生物学、TDP-43生物学或前分析质量；同行评审的原始研究、系统综述或权威指南；近十年内发表，基础性较老研究为历史背景纳入；直接测量相关标本基质中的TDP-43，从其他分析物推断效应的研究视为间接证据。作为叙述性综述，未应用正式质量评分或荟萃分析方法。
7. 综述的局限性
血小板TDP-43的证据基础仍然有限，许多可用证据是间接的，来自其他分析物、标本类型或实验系统。不同前分析条件下血小板TDP-43的直接稳定性数据稀缺，溶血、凝血、离心和储存对血小板TDP-43的具体影响尚未被系统表征。现有证据不允许按效应量对前分析因素进行排序，其相对重要性仍有待确定。引用研究的选择反映了作者的专业判断，强因果主张应解释为需要进一步实证验证的假设。
8. 结论
TDP-43相关神经退行性疾病中仍缺乏可靠的外周TDP-43病理生物标志物。近期证据表明血小板是易于获取且TDP-43丰富的血液区室，ALS中的初步研究报道了血小板TDP-43的疾病相关差异。溶血、凝血、离心条件、温度变化、储存时长和不受控的血小板活化不应被视为单纯的技术噪声，这些因素可影响血小板回收、活化状态、分子完整性和货物分布，从而改变测得的TDP-43水平。未来研究应使用针对分析终点专门设计的标准化程序，并明确报告样本基质、抗凝剂、处理时间、离心条件、储存历史、溶血、细胞纯度、血小板回收和活化状态。将血小板TDP-43从有前景的研究发现转化为临床有用生物标志物，需要生物学验证和可靠实验室程序相结合。本综述提出的框架可能为未来研究血小板作为不同疾病生物标志物来源的设计、标准化和解释提供有用基础。
