脂肪酸结合与S-亚硝基化相互作用的HSA结构决定因素：Cys34氧化还原位点与配体结合状态的偶联机制研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Structural Determinants Underlying the Interplay Between Fatty Acid Binding and S-Nitrosylation of Human Serum Albumin

　　

人血清白蛋白（HSA）是一种多功能蛋白质，其生物学特性不仅由氨基酸序列决定，还由功能位点、翻译后修饰及内源性配体之间的复杂相互作用所决定。然而，调控这些因素影响HSA功能状态的结构机制尚不清楚。本研究旨在以Cys34 S-亚硝基化和脂肪酸（FA）结合作为模型调控过程，探究HSA各功能区域相互作用的结构基础。为此，研究人员采用分子对接和分子动力学（MD）模拟，研究了无脂肪酸及载脂状态下天然与亚硝基化HSA的结构特征和构象动力学，以及它们与谷胱甘肽（GSH）和S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）的相互作用。通过¹H NMR波谱评估了HSA与GSNO孵育后整体结构的变化。MD分析显示，FA结合改变HSA的构象动力学，并影响Cys34及其他功能重要区域的结构环境。这些FA诱导的效应进一步受S-亚硝基化调节，后者以依赖脂肪酸结合状态的方式影响白蛋白的构象景观。HSA与GSNO孵育前后的一维¹H NMR谱高度相似，提示与亚硝基化试剂相互作用后整体蛋白结构未发生明显改变。所得数据揭示了FA结合与S-亚硝基化如何通过调节Cys34及其他功能重要区域的结构环境而塑造HSA的构象特性。结果强调了在研究HSA结构-功能关系时，应将翻译后修饰和内源性配体视为关键决定因素。

**研究背景与问题**

人血清白蛋白（HSA）是血浆中含量最高的蛋白质，占循环蛋白总量的50%以上，除维持血浆胶体渗透压和体液平衡外，还作为脂肪酸（FA）、胆红素、激素、胆汁酸、金属及多种药物的通用载体，并具有抗氧化与酶学性质，能够与血液及脑实质细胞膜上的某些酶和受体非特异性结合。HSA的每一类功能均由一组结构决定簇所决定，包括低分子量配体结合位点、氧化还原活性中心以及介导大分子相互作用的表面区域。尽管这些中心在功能上相对特化，但它们同处于一个构象柔性分子的统一动态系统之中，因此某一中心结构特征的改变可能影响其他功能的实现。然而，人们对这些位点之间相互影响的分子机制了解甚少，尤其是Cys34硝基化与脂肪酸结合之间的构效耦合。HSA可通过Cys34游离巯基共价结合一氧化氮（NO）形成S-亚硝基白蛋白（HSA-NO），后者不仅储存和转运NO，还可将NO基团转移至低分子量硫醇或膜相关蛋白，抑制血小板聚集，并在缺血-再灌注损伤和急性肺损伤中保护内皮细胞。Cys34巯基的反应性取决于其亲核性和空间可及性，而后者又受巯基微环境影响，可因白蛋白修饰或配体结合位点占据而改变。基于此，研究人员以Cys34硝基化和FA结合为范例，旨在揭示HSA功能位点相互作用的结构机制。

**关键技术与方法**

研究人员构建了四种三维模型：天然无FA的HSA（基于PDB 1AO6）、天然HSA与7分子油酸（OLA）复合物（基于PDB 1GNI）、无FA亚硝基化HSA（HSA-NO）及亚硝基化载脂HSA（HSA-OLA-NO），亚硝基化形式经CHARMM-GUI服务器构建。采用GROMACS 2023.3在CHARMM36力场下进行MD模拟，每个模型设三个独立重复、各100 ns；另用Autodock Vina对GSH/GSNO进行分子对接并对复合物作20 ns模拟。NMR实验使用未脱脂的商业HSA（IMTEK，莫斯科），于Bruker Avance III 500谱仪采集一维¹H NMR谱，GSNO按文献方法当日合成。

**研究结果**

2.1 三维分子建模模型的构建：研究人员以1AO6和1GNI晶体结构为基础，借助CHARMM-GUI构建了四种白蛋白模型，明确了结构域排布、FA1–FA7脂肪酸结合位点及Cys34氧化还原位点的空间关系，并指出FA7与Sudlow I药物位点重叠、FA4与Sudlow II重叠，同时展示了亚硝基化Cys34的氨基酸环境细节。

2.2 基于MD模拟的各修饰形式白蛋白的结构特征：所有模型的Cα原子均方根偏差（RMSD）在前20 ns逐渐升高后稳定于0.3 nm，表明体系达到构象平衡；无FA白蛋白的构象变化主要来自结构域DIII，载脂模型的域内局部变化明显减弱而整体变化主要源于结构域间的铰链运动。溶剂可及表面积（SASA）分析显示，无FA模型（尤其HSA-NO）SASA升高，HSA-OLA模型中略有下降，HSA-OLA-NO中几乎恒定；回转半径（Rg）呈相似趋势。均方根涨落（RMSF）分析表明各模型局部残基柔性分布相似，无FA模型在DI和DIII的涨落略高。主成分分析（PCA）前两个主成分解释63%的总变异，载脂形式沿第一主成分明显分离，说明FA结合是驱动构象状态改变的首要因素；无FA形式高度重叠，提示硝基化不引起整体结构重排，但HSA-OLA-NO沿第二主成分分布更宽，表明硝基化可扩展载脂蛋白可及构象谱。

2.3 天然与亚硝基化白蛋白形式的构象分析：基于50–100 ns轨迹以0.15 nm RMSD截断进行聚类并提取代表性结构，比较显示S-亚硝基化伴随整体形状的适度改变，而油酸结合导致更为伸展的构象；无论脂肪酸结合状态如何，硝基化均使白蛋白趋于较不紧凑的构象，但其结构基础在有无油酸时不同。

2.4 天然与亚硝基化形式白蛋白氧化还原位点的构象分析：HSA模型中Cys34巯基埋藏于蛋白球内部，可及性有限；硝基化后Cys34与邻近His39的相互作用丧失，但SNO基团硫原子仍处于埋藏状态；HSA-OLA模型中Cys34巯基对转亚硝基化最为可及，而HSA-OLA-NO中Cys34与Leu42靠近形成空间位阻，可能限制其与低分子量硫醇的相互作用。水合分析显示，油酸结合使Cys34硫原子3.5 ?范围内的平均水分子数增加近三倍，硝基化则使其减少，且两种硝基化形式水合数几乎相同。对Tyr150、Tyr411、Lys525与Trp214的类似计算表明，S-亚硝基化引起HSA个别功能重要区域水合的选择性改变；由于Tyr150、Tyr411和Lys525分别位于FA2、FA4和FA5内，提示硝基化可能调节FA结合区的局部环境。对接结果显示HSA-OLA/GSNO配对具有最优的反应基团空间排布和最短S–N距离。

2.5 用¹H NMR波谱研究HSA–GSNO相互作用：37 °C及室温下HSA与HSA-GSNO样品的一维¹H NMR谱高度相似，各谱区均无明显差异；谱中脂肪区（2.5–0.8 ppm）及约5.3 ppm信号归因于不饱和脂肪酸的乙烯基质子，0.0至–0.2 ppm信号为内标DSS。结果表明S-亚硝基化不引起大规模去折叠或结构重排，与MD所见的整体折叠保持而功能区内局部重排相一致。

**讨论与结论**

讨论部分指出，脂肪酸结合的影响不仅体现于蛋白空间组织改变，还体现于构象动力学特征及功能重要区域局部微环境的变化，这些变化可能通过蛋白构象景观的相互关联影响远处配体结合位点；硝基化不诱导整体折叠重排，但改变若干功能区的局部微环境。作者将NMR与MD视为互补手段：前者反映整体折叠的保持，后者揭示功能区内构象动力学与水合模式的局部改变。研究结果支持脂肪酸作为白蛋白转运功能与抗氧化功能之间“介质”的假说，并提示在将S-亚硝基化白蛋白水平用作NO依赖性过程生物标志物时，需考虑白蛋白的脂肪酸饱和程度；在药理学研究中，未脱脂的商业HSA亦可视为生理相关模型。文末还讨论了重组白蛋白标准化生产及临床应用的转化意义。结论译为：本研究采用计算建模与NMR波谱研究了人血清白蛋白中脂肪酸结合与Cys34 S-亚硝基化相互作用的结构机制。根据计算机模拟数据，油酸（OLA）结合伴随白蛋白构象动力学的改变、Cys34局部微环境的变化以及其他功能重要区域的修饰，这些变化可能影响Cys34巯基的结构环境及白蛋白与低分子量S-亚硝基硫醇的相互作用。关于Cys34 S-亚硝基化，分子动力学结果表明该修饰诱导功能位点微环境的局部改变，并以依赖脂肪酸的方式影响蛋白可及构象状态的分布，但不导致HSA整体结构的明显重排，后者与¹H NMR数据显示的蛋白与GSNO相互作用后整体构象状态保持的结果一致。因此，所得数据表明HSA的功能状态不仅由各个调控位点的性质决定，还由它们在统一动态蛋白结构中的相互联系所决定，凸显了内源性配体和翻译后修饰在调控其功能特性中的重要作用；所提出的方法强调了在研究决定蛋白功能状态的机制时考虑蛋白构象动力学及生理配体影响的重要性。