**五种浮萍（Lemnaceae）物种间基线转录组与营养培养基生理响应的比较分析**

《International Journal of Molecular Sciences》：Comparative Transcriptomic and Physiological Profiling Reveals Species-Associated Differences Across Five Duckweed Species

　　

浮萍（Lemnaceae）是生长迅速的水生单子叶植物，具有生物质生产与植物修复潜力，但物种间的基线分子与生理差异仍缺乏系统表征。研究人员对五种浮萍——*Lemna minor*、*Lemna japonica*、*Lemna gibba*、*Landoltia punctata*与*Lemna aequinoctialis*——在基础Murashige and Skoog（MS）培养基上培养（每物种三个生物学重复）的材料进行从头转录组组装，并以植物界（Viridiplantae）、胚胎植物（Embryophyta）与单子叶植物（Liliopsida）参考集进行基准通用单拷贝直系同源基因（BUSCO）完整性评估。直系同源组（orthogroup）水平的表达差异通过物种签名评分与Pearson相关分析刻画；基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）注释采用描述性组成分析与正式过表征检验加以考察。在一项独立实验中，于四种营养方案（MS培养基、Hoagland溶液、Gamborg B5培养基与无氮MS（MS–N）培养基）下培养7天后测定生物量、蛋白质含量、葡萄糖积累、过氧化物酶活性及叶绿素a/b浓度。所有组装均高度完整（完整BUSCO≥89%）。重复样本按物种聚类（种内r中位数=0.99，种间r中位数=0.40；标签置换检验p=1×10^?4），基于训练重复集筛选的物种签名能够正确判定每一个留出样本。GO与KEGG注释组成在物种间存在差异，但物种特异性富集检验中无任何条目达到错误发现率（FDR）≤0.10。培养基效应具有物种依赖性：相对于基础MS，MS–N使所有物种的蛋白质与叶绿素a降低、葡萄糖与叶绿素b升高，并使五个物种中四个的过氧化物酶活性升高。由于各培养基在多个组分上存在差异，上述效应不能单独归因于氮素。五个物种具有各自独特且可重复的基线转录组，并对营养培养基表现出不同的生理响应，为浮萍比较研究提供了可产生假设的资源。

**研究背景与科学问题**

浮萍（Lemnaceae）是地球上体型最小、形态高度简化的有花植物，约36个已确认物种分属*Spirodela*、*Landoltia*、*Lemna*、*Wolffiella*与*Wolffia*五属，隶属于单子叶植物泽泻目。其结构看似简单，仅为缺乏真正茎叶的叶状体（frond）且根系构型多变，但实为真正的维管单子叶植物，既能通过叶状体出芽进行快速营养繁殖，亦可在特定环境条件下开花进行有性生殖。在适宜条件下其生物量倍增时间仅24–48 h，属已知生长最快的植物之列。尽管形态保守，Lemnaceae的基因组多样性显著：基因组大小跨越约13倍范围，从*Spirodela polyrhiza*（*S. polyrhiza*）的约150 Mb到*Wolffia arrhiza*的逾1881 Mb，但所有已测序浮萍基因组均编码约19,000–22,400个蛋白编码基因的紧凑核心蛋白组。*S. polyrhiza*、*Lemna minor*（*L. minor*）、*Wolffia australiana*与*Spirodela intermedia*参考基因组的测序以及涵盖11份Lemnaceae材料的近期系统发育基因组学分析，共同揭示了古老的全基因组复制、广泛的杂交与多倍化，以及与水生生活方式和形态简化相关的基因家族收缩。

在单个浮萍物种中，转录组研究已提供重要功能线索：热胁迫下*S. polyrhiza*的RNA-seq鉴定出参与耐热性的ERF与GRAS转录因子网络；*Lemna gibba*（*L. gibba*）中整合转录组与代谢通量分析显示卡尔文-本森-巴沙姆循环与氧化戊糖磷酸途径同时活跃，并证明氮源深刻重塑三羧酸（TCA）循环通量；*L. gibba*水杨酸诱导开花过程中记录了转录本与蛋白质水平之间的转录后缓冲；*Lemna*属物种对辐照度的光合适应具有物种与材料特异性；*Lemna minuta*的单核RNA-seq揭示了与该物种形态简化一致的简化分子细胞类型图谱。然而，在共同条件下对多个Lemnaceae物种基线转录组进行系统的多物种比较仍然缺乏，这限制了对物种水平分子差异的理解。

在基础生物学之外，浮萍具有重要的生物技术价值：其高淀粉与蛋白质含量、可与大豆相当的蛋白质浓度与氨基酸谱，结合在边际水资源上无需土壤的快速生长，使其成为生物燃料、动物饲料与人类营养的可持续原料；*Landoltia*与*Lemma*属物种被用于市政、农业与工业废水的植物修复，氮磷去除效率分别可达98%与96%；浮萍还积累苯丙烷类、多胺与类黄酮等多种次生代谢物，由丰富的细胞色素P450（CYP）酶系介导。尽管如此，物种特异性生长能力与代谢物生产背后的分子程序在转录组水平上仍解析不足。在其他植物类群中，跨物种转录组比较已被用于区分共享性与物种特异性分子响应；基于直系同源组的比较转录组分析（借助OrthoFinder等工具将基因聚为进化相关基因组）为跨物种表达比较提供了原则性框架，可纳入多倍化导致的基因拷贝数与旁系同源含量变异；KEGG通路分析与GO术语富集则可在物种水平刻画注释基因内容差异。该方法尤其适用于存在多倍化、杂交与基因家族收缩、物种间基因-直系同源组关系多变的Lemnaceae。

**研究设计与主要结论**

为填补上述空白，研究人员开展了基线比较转录组分析与独立的生理分析。首先，对在单一标准条件（基础MS培养基）下培养的五个物种*L. minor*、*Lemna japonica*（*L. japonica*）、*L. gibba*、*Landoltia punctata*（*La. punctata*）与*Lemna aequinoctialis*（*L. aequinoctialis*）进行从头转录组组装，并以BUSCO评估完整性；其次，通过主成分分析（PCA）、Pearson相关矩阵与物种签名评分比较直系同源组水平表达；随后描述GO与KEGG注释组成并开展探索性物种特异性过表征检验；最后在独立实验中测定五物种在四种营养培养基上生长7天后的六项生理性状，包括鲜重生物量、蛋白质浓度、葡萄糖浓度、过氧化物酶活性、叶绿素a浓度与叶绿素b浓度。由于RNA-seq仅在基础MS上进行，转录组数据描述物种间基线差异，不用于解释培养基响应。总体结论为：五个物种具有独特且可重复的基线转录组，并对营养培养基表现出不同的生理响应，为浮萍比较研究提供了可产生假设的资源。

**关键技术方法**

研究材料为购自Rutgers Duckweed Stock Cooperative（RDSC）的五份浮萍材料（*L. minor* RDSC 7295、*L. japonica* RDSC 5697、*L. gibba* RDSC 8124、*La. punctata* RDSC 5635、*L. aequinoctialis* RDSC 8224）。主要技术方法包括：一是RNA提取与DNBSEQ平台双端链特异性RNA-seq测序（PE150），经fastp与MultiQC质控；二是以Trinity进行各物种从头转录组组装，并用CD-HIT-EST在99%一致性下去冗余，以BUSCO v6.0.0针对Viridiplantae、Embryophyta与Liliopsida三个数据集评估组装完整性；三是以TransDecoder预测蛋白、OrthoFinder推断直系同源组，并以Salmon量化转录本丰度；四是以eggNOG-mapper进行功能注释，结合组成分析与单侧超几何检验（Benjamini–Hochberg校正）开展GO/KEGG分析；五是采用平衡留出方案的物种签名评分与标签置换检验；六是生理指标测定（Bradford法测蛋白、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶/邻联茴香胺法测葡萄糖、愈创木酚法测过氧化物酶、80%丙酮提取分光光度法测叶绿素）及双因素方差分析（ANOVA）与Tukey多重比较。

**研究结果**

**2.1 从头转录组组装完整性高，去冗余降低转录本冗余度**：通过BUSCO对30个组装-数据库组合并行评估发现，Viridiplantae数据库下所有未去冗余组装完整度为98.2%–98.9%，完整BUSCO以重复拷贝为主；去冗余后单拷贝完整BUSCO比例显著上升而重复比例相应下降，总完整度仅下降0–0.2个百分点，*La. punctata*与*L. japonica*单拷贝增益最大。Embryophyta数据库下未去冗余组装完整度为91.8%–93.5%，模式类似；Liliopsida数据库下未去冗余与去冗余完整度分别为89.5%–91.3%与89.4%–91.2%，存在可检出的缺失BUSCO组分，*L. aequinoctialis*与*L. gibba*片段化比例最大，*La. punctata*缺失比例最低（4.3%）。由此得出结论：五个转录组组装均高度完整，去冗余减少了重复转录本表征；下游蛋白预测与表达定量使用未去冗余组装，去冗余组装仅用于配对BUSCO比较。

**2.2 比较转录组揭示物种特异性表达谱与高种内重复性**：在物种签名特异性评估中（2.2.1），采用243个平衡留出划分，每种物种签名从五物种共有的8040个直系同源组中选取30个，主配置下15个样本在其全部81次留出中出现正的同源减最高非同源评分边际，样本水平边际中位数为1.9159，在覆盖三个直系同源组全集、两种表达过滤与五种标记数的30种配置中均得以保持，标记列表Jaccard重叠中位数为0.8750–0.9355。主成分分析（2.2.2）将15个样本分为五个紧密物种簇，PC1（29.0%）区分*L. japonica*与*L. aequinoctialis*、*L. minor*，PC2（28.4%）区分*La. punctata*，前两成分解释57.4%方差；15,151个表达直系同源组的样本间Pearson相关显示种内中位r=0.99、种间中位r=0.40，标签置换检验p=1.0×10^?4。对物种均值方差最大的100个直系同源组分析（2.2.3）显示行z分数在?2.0至+2.0之间，每个物种至少对应一个区块，提示共同生长条件下的物种特异性表达模式，但该热图为描述性展示，未检验差异表达。物种水平相关矩阵（2.2.4）显示10个物种对相关系数为0.36–0.54，最高为*L. japonica*与*L. gibba*（r=0.54），最低为*La. punctata*与*L. aequinoctialis*（0.36），*L. aequinoctialis*与其他物种相关性普遍较低（0.36–0.39）；这些系数应视为表达谱相似性的相对度量而非进化距离。

**2.3 GO注释组成在物种间存在差异，但物种特异性过表征未获统计学支持**：通过计算各物种携带各GO术语的可注释直系同源组比例并作行z标准化（2.3.1），发现*L. japonica*核酸代谢过程、核腔等术语相对较高，大分子修饰与磷酸化相对较低；*La. punctata*大分子修饰、序列特异性DNA结合相对较高，阴离子结合与含氧酸代谢相对较低；*L. minor*膜与转运相关术语及糖基转移酶术语相对较高，核酸代谢与叶绿体相对较低；*L. gibba*叶绿体与质体类囊体术语相对较高，糖基转移酶与液泡/转运术语较低；*L. aequinoctialis*磷酸化、含氮碱基化合物生物合成、含氧酸与羧酸生物合成相对较高，序列特异性DNA结合与核腔较低。物种特异性GO过表征检验（2.3.2）采用单侧超几何检验与Benjamini–Hochberg校正，结果显示背景直系同源组为5–500的GO术语在物种限制性直系同源组中无一在FDR≤0.05或≤0.10下显著富集，展示的15个物种-术语结果FDR均>0.10；部分术语高倍数富集（如*L. japonica*二聚化术语约达50倍）源于前景直系同源组数极少且无统计学支持。需注意物种限制性反映转录本检出而非已证实的基因组缺失。

**2.4 KEGG注释组成与物种特异性过表征检验**：KEGG通路组成分析（2.4.1）显示*L. gibba*卡尔文循环碳固定、糖酵解/糖异生、光合作用与甲烷代谢比例相对较高；*La. punctata*半胱氨酸与甲硫氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导与内质网蛋白加工较高；*L. minor*淀粉与蔗糖代谢及泛素介导蛋白水解较高；*L. japonica*核糖体与甘油磷脂代谢较高而AMPK信号最低；*L. aequinoctialis* mTOR信号、氧化磷酸化、核质运输、剪接体与细胞周期较高。KEGG模块组成（2.4.2）与通路水平基本一致：*L. gibba*光呼吸、糖酵解核心与完整模块、糖异生、还原戊糖磷酸（卡尔文）循环及丝氨酸途径模块较高；*La. punctata*四个赖氨酸生物合成模块与木质素单体生物合成较高；*L. minor* C4-二羧酸循环（NADP-苹果酸酶型）、还原性柠檬酸循环与茉莉酸生物合成较高；*L. aequinoctialis*乙醛酸循环与柠檬酸循环模块较高；*L. japonica*无显著升高模块且糖酵解核心模块最低。物种特异性KO与通路富集检验（2.4.3）未鉴定出任何FDR≤0.10的术语，KO最大?log10(FDR)约0.33，通路约0.75，*L. japonica*无满足条件的前景直系同源组可供检验；排名靠前术语以KEGG定义形式作探索性描述。

**2.5 五物种四培养基生理谱分析**：对六项生理参数在四种培养基（基础MS、Hoagland盐溶液、B5、无氮MS即MS–N）下测定，双因素方差分析显示物种、培养基及其交互作用对多数性状显著。生物量（2.5.1）受物种、培养基及交互作用影响（均p<0.0001）；基础MS上*L. aequinoctialis*（168.2 mg）与*L. gibba*（166.2 mg）鲜重最高且彼此无差异，*L. minor*最低（72.7 mg）；*L. minor*在各培养基间无显著差异，*La. punctata*与*L. aequinoctialis*在三种替代培养基上均显著降低，且Hoagland与B5引起的降低幅度与MS–N相近，故不能特异地归因于氮素；鲜重仅在7天终点测定且未按初始生物量归一化。蛋白质浓度（2.5.2）主要受培养基影响（p<0.0001，η2p=0.91）且存在物种×培养基交互作用，物种主效应不显著（p=0.226）；MS–N使所有物种蛋白质浓度降至最低（较基础MS降低约49%–79%），*La. punctata*与*L. aequinoctialis*降幅最大（79%与78%）。葡萄糖浓度（2.5.3）受物种、培养基及交互作用影响，MS–N使所有物种葡萄糖升高（约2.7–5.0倍），*L. minor*基础MS上葡萄糖最高（34.77 μg mg^?1）且是唯一在Hoagland与B5上也升高的物种。过氧化物酶活性（2.5.4）在基础水平与培养基响应性上均存在明显物种差异，*L. aequinoctialis*基础活性最高（57.16 U mg^?1），MS–N使五物种中四个活性升高，*La. punctata*比例增幅最大（约7.4倍），*L. aequinoctialis*在MS–N上绝对值最高（190.8 U mg^?1）；因仅测单一氧化还原相关参数，不能据此推断活性氧（ROS）积累或清除能力。叶绿素a浓度（2.5.5）受物种、培养基及交互作用影响，MS–N使所有物种叶绿素a降至最低（降低约31%–67%），与叶绿素生物合成需氮一致。叶绿素b浓度（2.5.6）响应不同于叶绿素a，MS–N使所有物种叶绿素b升高，*L. gibba*（8.11）、*La. punctata*（8.91）与*L. aequinoctialis*（7.96）增幅最大；因叶绿素a与b反向变化，由组均值计算的叶绿素a/b比从基础MS的2.0–3.5降至MS–N的0.4–1.6。

**讨论与结论**

讨论指出，五个转录组组装的高BUSCO评分（Viridiplantae 98.2%–98.9%、Embryophyta 91.8%–93.5%、Liliopsida 89.4%–91.3%）表明组装质量足以支持稳健的直系同源组水平比较分析；99%核苷酸一致性去冗余将部分重复BUSCO转为单拷贝而未降低总完整度，但重复BUSCO在所有组装中仍占多数，这与同源或旁系拷贝核苷酸差异超过1%或保留可变剪接异构体的情况相符，也与Lemnaceae中已报道的杂交与多倍化相容；*La. punctata*与*L. japonica*增益较大可能提示其组装中可折叠冗余更多，但BUSCO重复无法区分等位、同源、旁系与组装来源拷贝。重复样本高度一致（种内r中位数0.99）而种间相关性低得多（中位0.40），并经考虑样本对依赖性的标签置换检验支持；物种签名在243个平衡划分中正确判定全部留出重复，且对签名大小、过滤阈值与候选集稳健，解决了在同一样本上选择与评估签名的循环性问题，但分析仍限于单一实验且每物种仅一个材料，物种身份可能与培养批次部分混杂，尚需检验签名反映的是物种还是材料特性。物种均值相关性0.36–0.54，*L. aequinoctialis*与其他四物种最不相似，与其在系统位置上与*L. minor*、*L. gibba*、*L. japonica*分离一致；但表达相似性并不简单镜像分类学——涉及*La. punctata*的属间配对并非最不相似，而被描述为*L. minor*与*L. turionifera*杂交种的*L. japonica*与*L. gibba*比与*L. minor*更相似，提示表达谱相似性综合了系统发育亲缘与谱系特异性调控及技术因素。

功能分析区分了注释组成与统计过表征：GO与KEGG注释组成在物种间存在差异，但仅描述各转录组中注释基因的相对表征，不衡量通路活性、酶活性、代谢物水平或代谢通量；且物种特异性GO、KO与通路富集检验均未达预设FDR≤0.10阈值，缺乏统计支持可能反映物种特异性直系同源组数量少（取决于各组装中的转录本检出）、从头组装转录本注释不完整、远缘物种注释迁移以及多术语多重检验负担等公认局限，故注释模式仅作假设而非结论。部分跨注释水平一致的模式值得靶向随访：*L. gibba*质体相关GO术语较高与卡尔文循环、糖酵解/糖异生及光呼吸注释较高相吻合，但是否对应光合能力差异需气体交换、酶活或通量测定验证；*La. punctata*半胱氨酸与甲硫氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、赖氨酸与木质素单体生物合成注释较高，提示硫氨基酸、硫醇与苯丙烷类代谢假设；*L. minor*液泡膜、阳离子转运、糖基转移酶及淀粉与蔗糖代谢注释相对较高；*L. aequinoctialis*柠檬酸循环与乙醛酸循环模块及生物合成过程术语提示中央代谢相关基因内容差异。上述假设均需在转录本、蛋白质与代谢物水平验证，尤其因浮萍中转录本与蛋白质丰度可能解耦。尽管RNA-seq与生理实验均包含基础MS，但二者独立进行，故仅解释基础对照生长下五物种的比较转录组谱。

生理方面，所有物种对营养培养基变化均有响应，但幅度乃至方向存在物种差异：相对基础MS，MS–N使所有物种蛋白质与叶绿素a降低、葡萄糖与叶绿素b升高，并使四个物种鲜重降低、过氧化物酶活性升高，这些模式与氮限制的已知效应大体一致，包括氮限制时蛋白质合成减少与碳水化合物积累，*L. aequinoctialis*中亦有胁迫相关碳水化合物（淀粉）积累报道。然而各培养基除氮外多个组分不同：基础MS含约60 mM氮，B5约27 mM，Hoagland 2号配方约15 mM，但铵硝比、钾、磷、钙、镁、铁螯合物、微量元素与维生素含量亦不同；无氮配方省略KNO₃且无补偿性钾盐，使MS–N钾浓度较基础MS低16倍（1.25 vs 20.0 mM）且不含维生素。因此Hoagland与B5的响应不能沿单一养分梯度排序，MS–N响应亦应解释为对氮缺失及伴随培养基组成变化的响应。物种响应差异仍然明显：物种×培养基交互作用对全部六项性状显著；*L. minor*在任何培养基上鲜重与过氧化物酶活性均无显著变化，但MS–N上葡萄糖绝对增幅最大且是唯一在Hoagland与B5上葡萄糖亦升高的物种；*La. punctata*与*L. aequinoctialis*在MS–N上蛋白质比例降幅最大且在所有替代培养基上鲜重均降低；*L. aequinoctialis*兼具最高基础过氧化物酶活性与替代培养基上最大绝对增幅，*La. punctata*比例增幅最大。由于测定仅在7天后进行，这些差异可能部分反映物种在生长速率、叶状体大小与内部氮储备上的差异而非长期耐性差异。蛋白质以Bradford法测定（定量染料结合可溶性蛋白），所有性状以鲜重归一化，而组织含水量可变，若要与通常以干重表示的浮萍蛋白含量直接比较则需基于干重的测定。

过氧化物酶活性在五个物种中四个于替代培养基上升高，且在处理水平上过氧化物酶活性最高的培养基通常叶绿素a浓度最低；III类过氧化物酶活性升高在非生物胁迫下常见报道（包括*L. aequinoctialis*），但III类过氧化物酶也参与细胞壁形成、木质化与生长素代谢。然而仅过氧化物酶活性不能衡量ROS积累、氧化损伤或ROS清除能力，稳健评估氧化胁迫需联合测定氧化剂、氧化损伤标志物与多种抗氧化组分；研究未测H₂O₂、脂质过氧化或其他抗氧化酶，故仅将过氧化物酶数据描述为培养基依赖的酶活性变化，不据此推断ROS管理；同样，每组三个生物学重复下未检验过氧化物酶活性与叶绿素含量的相关性，任何此类关联也不意味着因果关系。MS–N上叶绿素a下降与叶绿素生物合成需氮一致；叶绿素b同时升高致三个物种计算所得叶绿素a/b比低于1则不寻常——较低的a/b比通常与相对更大的捕光天线相关，但绿色组织中低于1的比例少见（通常约2.5–3.5）；由于叶绿素由80%丙酮粗提物分光光度法估算，营养限制下形成的叶绿素降解产物或其他色素的波谱贡献可能影响估计，尤其当叶绿素a较低时。因此不将叶绿素b升高解释为天线重塑证据，需HPLC色素分析与捕光复合体蛋白测定确认。

研究局限包括：转录组与生理谱分析采用单一标准化条件集（转录组为基础MS，生理为四种培养基），多种参数下的条件依赖性转录组差异尚未表征；转录组与生理实验未匹配，转录组签名无法与培养基响应关联；每物种仅一个材料与三个生物学重复，限制外推与统计效力；生理测定周期短（7天）、以鲜重归一化，且所比较培养基除氮外多种养分不同（包括MS–N中钾较低与无维生素）；bulk RNA-seq无法解析细胞类型特异性贡献，鉴于Lemnaceae具表皮、叶肉、维管与分生组织细胞类型，如应用于*Lemna minuta*的单核RNA-seq可阐明物种差异反映细胞类型组成、细胞类型内调控抑或二者兼有；未直接测定代谢通量、代谢物池或ROS，未以qRT-PCR等独立分子方法验证，叶绿素估计基于粗提物分光光度法需色谱确认；注释模式的蛋白质水平对应关系未确认，尤其对已报道相关*Lemna*物种存在广泛转录后调控的*La. punctata*，匹配的蛋白质组与代谢组有助于验证功能相关性。尽管研究仅提供基线转录组资源与物种水平生理比较，仍可生成未来工作的假设，例如*L. minor*跨培养基稳定的鲜重、*La. punctata*与*L. aequinoctialis*在基础MS上相对较高的蛋白质浓度、*L. gibba*与*L. aequinoctialis*在基础MS上的高鲜重，均提示可在长期生长试验中评估的候选性状；任何饲料或食品生产、植物修复或生物炼制应用均需在应用相关条件下实验验证，包括多材料、基于干重的组成、更长培养期与放大研究；随着更多Lemnaceae基因组与系统发育基因组学资源可用，还可检验此处的表达差异反映系统发育、生态还是谱系特异性基因家族变化。

研究结论（原文翻译）：本研究对五种浮萍——*L. minor*、*La. punctata*、*L. japonica*、*L. gibba*与*L. aequinoctialis*——的基线转录组及营养培养基生理响应进行了比较描述。在共同生长条件下，五个物种表现出独特且可重复的直系同源组表达谱，物种签名在所有平衡验证划分中均正确判定留出重复样本。GO与KEGG注释组成在物种间存在差异，但物种特异性富集检验无统计学显著性，故注释模式作为供靶向验证的假设而非物种特异性通路活性的证据呈现。在独立实验中，物种对四种营养培养基的生理响应存在差异；无氮MS使所有物种蛋白质与叶绿素a降低、葡萄糖与叶绿素b升高，但各培养基在多个组分上不同，且未在匹配条件下获得转录组与生理数据。这些数据集为比较Lemnaceae生物学提供了资源，并可能有助于为未来实验优先选择物种与性状，包括匹配的转录组-生理研究、多材料、更长培养期以及在应用相关条件下的验证。