《International Journal of Molecular Sciences》：Exploration of Alternative Approaches to Citron Kinase Inhibition for Glioblastoma Treatment
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胶质母细胞瘤（GBM）仍是一种高度侵袭性的脑肿瘤，治疗选择有限，凸显了识别新的肿瘤易感性的必要性。Citron激酶（CITK）是一种参与细胞质分裂和基因组稳定性的蛋白，为神经祖细胞的增殖和存活所必需，此前已作为髓母细胞瘤（MB）的潜在治疗靶点而出现。在本研究中
胶质母细胞瘤（GBM）仍是一种高度侵袭性的脑肿瘤，治疗选择有限，凸显了识别新的肿瘤易感性的必要性。Citron激酶（CITK）是一种参与细胞质分裂和基因组稳定性的蛋白，为神经祖细胞的增殖和存活所必需，此前已作为髓母细胞瘤（MB）的潜在治疗靶点而出现。在本研究中，研究人员在两种患者来源的GBM干细胞模型中研究了CITK耗竭和药理学抑制的作用。CITK通过siRNA耗竭，或使用迄今描述的第一个选择性激酶抑制剂C3TD879（c879）进行药理学靶向。研究人员还探索了多药理学抑制剂Lestaurtinib。评估了对球体生长、细胞质分裂、细胞毒性、DNA损伤相关蛋白、凋亡标志物和细胞周期调节因子的影响。CITK耗竭部分损害了球体生长，轻微增加了多核化，并在两种GBM模型中导致细胞毒性，而对DNA损伤相关蛋白的影响则取决于细胞系。使用c879进行的选择性CITK抑制轻微降低了球体生长，并且仅部分重现了CITK耗竭的细胞和分子效应。Lestaurtinib产生了更强的球体生长抑制和细胞质分裂缺陷，同时诱导有限的细胞毒性和异质的分子反应。总之，所测试的GBM模型被证明对CITK耗竭和选择性催化抑制具有中等敏感性，而Lestaurtinib显示出最强的效应，并仅部分模拟了CITK缺失的效应。
胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是成人中最具侵袭性和致死性的原发性恶性脑肿瘤之一，具有广泛浸润、坏死和对常规治疗抵抗等特征，约占全部胶质瘤的57%和原发性恶性中枢神经系统（CNS）肿瘤的48%，5年相对生存率仅6.8%。自2005年Stupp方案确立以来，最大范围安全手术切除联合放疗及替莫唑胺（TMZ）同步和辅助化疗成为新诊断患者的标准治疗，中位总生存期提高至14.6个月。然而，肿瘤显著的间质和瘤内异质性及内在的放化疗抵抗严重限制了现有治疗策略的效果，尽管免疫治疗、EGFR与VEGF抑制剂、分子靶向治疗及溶瘤病毒等多模式疗法正在临床试验中探索，临床结局仍不理想，亟需更具肿瘤选择性的治疗策略。近年来，靶向对肿瘤生长和存活至关重要的分子脆弱性成为研究热点，原发性先天性遗传性小头畸形（MCPH）相关基因因编码中心体功能、细胞周期进程、DNA损伤反应和基因组稳定性维持等关键蛋白，且在多种肿瘤中高表达，被认为是颇具吸引力的候选治疗靶点。其中，Citron激酶（CITK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在发育中神经祖细胞分裂晚期发挥关键作用，参与中体组织和稳定性维持以促进胞质分裂完成，并参与DNA双链断裂（DSBs）修复及有丝分裂纺锤体方向调控。研究人员此前已证明CITK耗竭在髓母细胞瘤（MB）体内外均产生显著抗肿瘤效应，包括损害胞质分裂和同源重组（HR）介导的DSBs修复，导致DNA损伤累积、TP53家族激活、细胞周期阻滞和凋亡，并在其他肿瘤类型中也有类似的抗增殖效应报道。然而，人源类器官和突变小鼠研究显示激酶失活突变产生的表型明显轻于CITK完全缺失，且首个高选择性CITK抑制剂在广泛肿瘤细胞系中未显示可检测的抗增殖活性，提示激酶非依赖功能可能参与其生物学活性。鉴于神经祖细胞对CITK缺失或突变的选择性脆弱性及神经祖细胞与胶质瘤干细胞（GSC）的分子相似性，GSC可能表现出对CITK的特异性依赖。因此，本研究旨在患者来源GSC中考察CITK耗竭与选择性药理抑制的效应，同时评估对CITK特异性低但能有效抑制MB细胞生长并模拟CITK缺失多种后果的多药理学抑制剂Lestaurtinib。结果表明GSC对CITK耗竭敏感，对Lestaurtinib治疗更为敏感，同时揭示了分子反应的大量异质性及与MB细胞的重要差异，为认识CITK作为GBM治疗靶点的局限性提供了见解。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用两株患者来源GSC系BT302和BT452（2009年和2011年取自意大利米兰Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta行手术切除的GBM患者，经机构伦理委员会批准并获书面知情同意，于第17–18代使用）以神经球形式培养；通过siRNA转染实现CITK敲低；利用Incucyte?活细胞分析系统进行单球体和多球体生长监测；采用CellTox Green细胞毒性检测和MTS法评估细胞活力；通过免疫荧光（DAPI/鬼笔环肽染色）定量多核细胞；以Western blot检测CITK、BRCA1、RAD51、γH2AX、cCASP3、pTP53、p21、p27等蛋白水平；并使用高选择性CITK抑制剂C3TD879（c879）和多靶点抑制剂Lestaurtinib进行药理学干预。
**2.1 CITK敲低轻度损害GBM干细胞生长与胞质分裂**：通过siRNA使两株GSC中CITK蛋白降低约70%，单球体实验显示CITK沉默显著损害球体生长，第7天BT302和BT452分别较对照减少约50%和32%；多球体实验中BT302显著减小而BT452无显著变化；免疫荧光显示CITK敲低使BT302多核细胞由4%增至6.5%、BT452由13%增至17%，提示胞质分裂受损但幅度有限且两株细胞存在差异。
**2.2 CITK沉默对GSC系DNA损伤反应的影响存在差异**：Western blot显示BT302细胞中CITK敲低降低BRCA1和RAD51水平并升高γH2AX，与既往发现一致；而BT452中上述指标基本不变，提示CITK敲低对不同GSC的DNA损伤信号和HR相关蛋白影响不同。
**2.3 CITK耗竭增加细胞毒性但凋亡标志物激活有限**：CellTox Green检测显示CITK耗竭显著增加两株球体的细胞毒性荧光信号（BT302阳性面积18.5%对12.9%，BT452为6.75%对4.4%）；MTS显示BT302活力显著降低而BT452无显著差异；cCASP3仅BT302呈非显著轻度升高，pTP53在BT302中度升高、BT452无显著变化，提示经典凋亡并非主要死亡机制；p21在两株中轻度降低，p27则显著升高且BT302更明显。
**2.4 选择性CITK抑制剂C3TD879降低GSC球体生长而对胞质分裂影响有限**：单球体实验中1 μM c879显著降低BT302球体生长且5 μM作用更强，呈剂量依赖；BT452在1和5 μM下均显著降低但幅度相近；多球体实验中BT452在5 μM下显著降低而BT302无统计学差异；免疫荧光显示5 μM c879显著增加BT302多核细胞，BT452呈类似趋势但未达统计学意义。
**2.5 C879增加细胞毒性、不明显影响DNA损伤相关标志物并差异调节p27**：CellTox Green显示5 μM c879显著增加两株GSC细胞毒性，1 μM作用有限；MTS亦显示活力下降；cCASP3在BT302 1 μM时轻度升高但无统计学意义，5 μM时与对照相当，BT452无显著变化；pTP53仅BT302 1 μM时轻度升高，BRCA1、RAD51、γH2AX均无显著改变；p21无显著变化，p27在两株中升高但仅BT302 1 μM达统计学意义，提示选择性抑制CITK激酶活性不能完全复制CITK沉默的表型。
**2.6 Lestaurtinib损害GSC球体生长与胞质分裂**：100 nM Lestaurtinib处理后24 h即显著抑制两株球体生长，第7天BT302和BT452面积分别较对照减少78%和64%，多球体实验结果类似；Western blot显示Lestaurtinib使BT302和BT452的CITK蛋白分别降低63%和38%，并显著增加两株多核细胞比例。
**2.7 Lestaurtinib诱导有限细胞毒性和细胞系特异性DNA损伤反应并升高p27**：CellTox Green显示BT302细胞毒性约增加10%但无统计学意义，BT452显著增加但幅度有限；两株cCASP3均无显著变化；pTP53在BT302不变而BT452轻度显著升高；MTS显示两株代谢活性一致下降；BT302中γH2AX升高、BRCA1降低而BT452无显著变化；p21无显著改变，p27在两株中均显著升高，提示其抗增殖作用可能涉及p27相关细胞周期调控和代谢活性降低等非经典凋亡机制。
讨论部分指出，本研究考察GSC是否共享MB细胞中对CITK缺失的脆弱性以及选择性或多药理学抑制剂能否重现该效应。结果显示CITK耗竭可损害患者来源GSC生长，但在细胞和分子反应的一致性上与MB存在显著差异：球体生长抑制较DNA损伤或凋亡更为一致，而p27升高在三种处理中均出现，提示p27可能是共同参与者。与MB相比，CITK耗竭引起的多核化程度较轻且两株GSC基线多核化水平较高，提示胞质分裂失败本身难以解释生长抑制；DNA损伤相关反应在GBM中更弱且更异质，可能与BT452的TP53突变状态相关。两株模型中生长抑制均仅伴有限经典凋亡证据，cCASP3、pTP53和p21变化有限，不支持TP53–p21反应的主要贡献，而p27显著升高提示p27依赖反应可能参与抗增殖效应；鉴于p27可与CITK相互作用参与胞质分裂调控，其积累机制及功能必要性值得进一步研究。c879实验表明GSC不同于既往无抗增殖反应报道的肿瘤细胞系，对选择性CITK抑制有反应，但仅重现CITK耗竭的部分效应，提示单纯抑制催化活性可能不足以复制蛋白耗竭的全部抗增殖后果，原因可能包括药理抑制不完全、c879细胞活性有限或CITK非催化功能的贡献，因而靶向蛋白降解（如PROTACs）可能是更合适的策略。Lestaurtinib产生更强的生长抑制和胞质分裂缺陷并降低CITK蛋白，但其分子反应未完全复制MB中的表型，且因其抑制多种激酶，其更强活性不能特异归因于CITK抑制。研究的主要局限在于仅使用两株患者来源GBM模型，无法评估这些反应对GBM广泛分子异质性的代表性。总体而言，研究提示CITK可能并非患者来源GSC中非常显著的脆弱点，并揭示了CITK耗竭与选择性激酶抑制之间的重要差异；催化与非催化功能及多药理学抑制的CITK非依赖效应可能共同参与观察到的反应，而两株模型间的异质性表明CITK扰动后果高度依赖背景。明确这种异质性的机制（包括p27积累的功能相关性）并将分析扩展至更广泛的患者来源模型，对于确定CITK能否及如何作为GBM治疗靶点（至少在部分病例中，并最终与现有标准治疗即电离辐射和替莫唑胺或其他DNA损伤药物联合）被有效利用至关重要。研究结论为：所测试的GBM模型对CITK耗竭和选择性催化抑制表现出中等敏感性，而Lestaurtinib显示出最强效应，且仅部分模拟CITK缺失的效应。
