干扰素信号激活决定胰腺癌对KRASG12D靶向治疗敏感性

《Cancer Cell》：KRASG12D-targeted therapy sensitivity depends on interferon signaling activation in pancreatic cancer

KRAS^G12D是胰腺癌的主要驱动因素，然而对KRAS^G12D靶向治疗固有耐药的机制基础仍不明确。研究人员通过对242例患者来源类器官（PDOs）及配对的肿瘤组织进行基因组学、转录组学和蛋白质组学的整合分析，发现了一个对KRAS^G12D靶向治疗药物存在固有耐药的KRAS^G12D突变亚群，其特征是固有免疫信号通路的显著下调。功能验证表明，在敏感模型中抑制干扰素信号可诱导耐药，而激活干扰素信号，尤其是干扰素β（IFN-β），可提高耐药模型的敏感性。将IFN-β与KRAS抑制剂（MRTX1133、HRS-4642和RMC-6236）联合使用，在固有耐药的胰腺癌中表现出协同抗肿瘤效应。在机制上，持续的MYC活性与对KRAS抑制的敏感性减弱相关，并与干扰素信号受抑制相关，提示其可能在促进固有耐药中发挥作用。这些发现确定干扰素信号是KRAS靶向治疗反应的候选决定因素，并支持基于干扰素的联合方案作为固有耐药胰腺癌的潜在治疗策略。

胰腺癌是一种侵袭性恶性肿瘤，5年生存率约为13%，且全球发病率持续上升。胰腺导管腺癌（PDAC）占胰腺癌的90%以上，以KRAS原癌基因高频突变为特征，约90%的病例携带KRAS改变。实验模型显示，通过多种机制对KRAS进行基因敲除可诱导细胞周期阻滞、凋亡、肿瘤消退及免疫激活；癌基因KRAS信号还通过促进关键免疫抑制细胞的募集与极化，协调免疫抑制微环境的形成，由此确立了KRAS在PDAC生物学与治疗中的关键靶点地位。KRAS长期被视为“不可成药”，而KRAS^G12C抑制剂sotorasib的突破性获批推动了其他KRAS抑制剂的研发。KRAS^G12D突变约占胰腺癌的40%，凸显了KRAS^G12D特异性抑制剂的临床重要性。MRTX1133等药物在多种KRAS^G12D驱动的癌症中显示出临床前疗效，并在胰腺癌模型中诱导显著肿瘤消退，部分通过免疫调节实现。然而，早期临床结果有限，部分患者仅观察到部分缓解和有限的总体缓解率。KRAS靶向治疗临床疗效有限归因于耐药性的产生，这是胰腺癌及其他KRAS驱动恶性肿瘤面临的严峻挑战。ASP3082和JDQ443等新型研究药物在早期试验中客观缓解率低、耐药显著，与MRTX1133的有限活性相似。这些观察结果凸显了阐明胰腺癌对KRAS^G12D抑制剂的固有耐药与获得性耐药机制的迫切需求。

本研究基于多组学（WGS、bulk RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、snRNA-seq）分析的扩大胰腺癌类器官生物样本库，组装了由215例PDAC、12例腺鳞癌（ASC）、5例神经内分泌癌（NEC）、3例腺样囊性癌（ACC）和7例导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）组成的242例队列。11种KRAS突变类型中，G12D（47.93%）、G12V（29.34%）和G12R（7.02%）占多数。MRTX1133药敏谱显示突变类型依赖性敏感性，以曲线下面积（AUC）排序，G12D类器官最敏感，其次为Q61H、G12C、G12V、野生型（WT）和G12R。WGS证实类器官肿瘤含量高，KRAS变异等位基因频率（VAF）中位数约56%，与单等位基因突变状态一致；AUC与KRAS VAF无显著相关性。尽管KRASG12D类器官总体最敏感，但部分显示明显耐药，提示该突变类型内对KRAS^G12D靶向治疗反应存在固有异质性。标准化AUC呈双峰分布，以非G12D为参照，将G12D类器官分为相对敏感组与相对耐药组，耐药亚群占19%；116例KRAS^G12D类器官密度图进一步划分出敏感与耐药群体。IC₅₀与AUC强相关（r=0.924），故采用AUC衡量治疗反应。基于药敏的层次聚类鉴定出3个亚组：22例相对耐药、34例高度敏感和60例中度敏感。在约70例覆盖六种主要KRAS突变类型的类器官中评估HRS-4642和RMC-6236的反应，结果与既往报道一致：HRS-4642对KRAS^G12D类器官高度特异，RMC-6236在KRAS^G12D、^G12C和^G12V突变类器官中活性增强。MRTX1133耐药类器官对HRS-4642和RMC-6236同样耐药，且这种交叉耐药是相互的；采用同样的AUC分层，HRS-4642与MRTX1133的一致率为68.75%，RMC-6236与MRTX1133的一致率为68.42%，表明固有耐药与敏感亚型在多种靶向药物中普遍存在。耐药组与敏感组KRAS VAF中位数均超过50%，肿瘤突变负荷无显著差异，RNA分子分型在两组间无富集，提示KRAS^G12D靶向治疗的固有耐药主要由肿瘤细胞的细胞自主性改变驱动。

为探究固有耐药的内部机制，研究人员对KRAS^G12D突变胰腺癌进行多组学分析，整合类器官来源的WGS、bulk RNA-seq、ATAC-seq、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学以及人肿瘤组织snRNA-seq数据。单核苷酸变异（SNV）、深度缺失、扩增和融合分析显示，两组主要驱动基因（KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4）频率相当，ARID1A、MYC和APOBEC3B改变相似，个别类器官存在罕见融合（如NUP98-CDKN1C和AXIN1-LMF1），两组间癌症相关基因组改变无显著差异。相反，KRAS下游信号相关基因呈现不同模式：耐药类器官相对富集MAPK通路改变（FGFR3、RASA4、RAF1、MAP2K1和MAPK1），敏感类器官富集PI3K-AKT和RALA-RALB轴基因（RALBP1、ARF6、EXOC2和RAC3）。固有免疫相关基因（MHC I类分子和S100钙结合蛋白家族）扩增在耐药组频率低于敏感组。为评估MRTX1133是否在体外诱导克隆选择，对3例耐药PDOs处理5天后行全外显子测序，比较治疗前后癌症相关突变谱、癌细胞分数（CCFs）和VAFs，发现高频突变和VAF保持稳定，CCF分析未检出新生克隆，表明耐药并非源于明显的遗传克隆选择。

对耐药与敏感KRAS^G12D类器官转录组和蛋白质组行基因集富集分析（GSEA）。RNA水平上，耐药组上调KRAS信号下调（KRAS Signaling Dn）、上皮-间质转化（EMT）和异源物质代谢，下调固有免疫信号通路，包括干扰素α（IFN-α）和IFN-γ反应、经NF-κB的TNF-α信号及炎症反应。整合多组学揭示转录与翻译输出间的调控解耦，仅少数基因RNA与蛋白表达一致，提示重要的转录后调控；蛋白质组分析证实耐药组免疫信号通路显著受抑（经NF-κB的TNF-α信号除外）。ATAC-seq显示耐药类器官上调基因染色质可及性增加、下调基因可及性降低。磷酸化蛋白质组显示免疫相关磷酸化蛋白（CD47、TGFB1I1和SIGIRR）水平降低，部分上调磷酸化蛋白富集于异源物质代谢，部分下调基因与IFN-α反应相关。这些数据支持固有免疫抑制是KRAS^G12D靶向治疗耐药的关键机制。

为在原始胰腺肿瘤中验证类器官发现，对10例耐药和13例敏感病例的23份患者肿瘤组织行snRNA-seq，过滤后获得170,309个高质量细胞核，每核平均1,812个RNA特征。基于经典标记将细胞注释为13个簇，代表恶性细胞、导管细胞、腺泡细胞、内皮细胞、内分泌细胞、施万细胞、周细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs）、肥大细胞、浆细胞、B细胞、T细胞和髓系细胞，各样本细胞组成大体相似。耐药肿瘤恶性细胞和CAF比例较低，腺泡细胞和T细胞比例较高。聚焦恶性上皮细胞，无监督聚类未能将耐药与敏感组的恶性细胞分为离散簇，提示总体转录状态大体相似；10个已建立的胰腺癌标记仅鉴定出KRT19高表达或MUC1升高的亚群。尽管如此，GSEA显示耐药肿瘤恶性细胞富集KRAS信号下调，IFN-α和IFN-γ反应信号通路减弱，经精选信号基因集重现，支持体内干扰素信号减弱。值得注意的是，耐药组所有细胞类型干扰素信号和干扰素均低于敏感组对应细胞，以恶性细胞和导管细胞下调最显著；由于功能和药理模型以肿瘤细胞为中心且KRAS抑制剂直接作用于癌细胞，后续机制分析聚焦于该区室。

基于耐药类器官固有免疫信号受抑的多组学证据，对模式识别受体（PRRs）及下游通路行单样本GSEA（ssGSEA）。与敏感类器官相比，耐药类器官这些通路普遍下调，尤其是IFN-α、IFN-γ和cGAS-STING信号。药敏AUC与选定固有免疫信号通路的探索性相关分析提示弱负相关。耐药系TLR2、CGAS和IL17RB水平较低，干扰素相关受体无显著差异；肿瘤类器官干扰素表达和通路活性低于正常类器官。为评估固有免疫信号的功能影响，将免疫抑制与免疫刺激因子与MRTX1133体外联合处理。敏感类器官中，MRTX1133联合免疫抑制因子（依那西普，TNF抑制剂；sifalimumab，抗IFN-α单克隆抗体）单独不影响活力，但显著增加对MRTX1133的耐药；抑制cGAS-STING（RU.521）和NF-κB（BAY-11-7082）无实质影响。相反，耐药类器官中刺激IFN-α/β、IFN-γ或TNF-α信号表现出中度细胞毒活性并部分恢复对MRTX1133的敏感性，而刺激cGAS-STING和PRR信号作用有限。药物相互作用分析显示IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α与MRTX1133联合均具协同效应，以IFN-β作用最强。sifalimumab处理敏感类器官显著抑制干扰素刺激基因（ISGs）如RSAD2和ISG15表达，而耐药类器官补充IFN-β上调这些效应分子。RNA-seq证实sifalimumab抑制IFN-α/γ反应通路，而IFN-β激活干扰素反应；干扰素抑制促进增殖及MYC靶基因V1、减少KRAS信号下调，干扰素激活则逆转这些效应。敏感类器官对IFN-β单用及联合MRTX1133有可测量反应，但联合效应的幅度和模式与耐药模型不同。IFN-β与HRS-4642和RMC-6236等其他KRAS靶向药物表现出中度协同，而与5-FU或吉西他滨几乎无协同。剂量矩阵和四种互补分析模型均提示细胞因子与MRTX1133间为协同相互作用而非非特异性毒性，以IFN-β与MRTX1133联合效应最强。这些结果反映IFN-β与KRAS靶向治疗间存在优先协同相互作用，而非加性毒性，并确定干扰素信号减弱是固有耐药的关键决定因素。

随后检验干扰素信号通路激活能否影响对KRAS^G12D靶向治疗的耐药。耐药类器官系中，IFN-β或MRTX1133单用均减小类器官大小和数量，联合则对增殖的抑制显著强于任一单药。碘化丙啶（PI）染色证实IFN-β单用具中度细胞毒性，联合治疗则大幅增加肿瘤细胞致死性。为验证特异性，构建6例IFNAR1敲低类器官，3种不同短发夹RNA（shRNAs）有效抑制IFNAR1转录；这些细胞系中IFN-β未能诱导下游基因表达，联合敏感性明显降低。体内DAC-154异种移植中IFNAR1敲低不影响肿瘤生长，免疫荧光（IF）染色证实有效敲低（IFNAR1^low/GFP⁺），Ki-67或CC3阳性无变化，表明IFNAR1缺失不影响体内增殖或凋亡；IFNAR1敲低减弱IFN-β与MRTX1133联合治疗的反应。用JAK-STAT通路抑制剂（ruxolitinib）单用或联合MRTX1133处理耐药类器官，JAK-STAT抑制剂单药作用很小，但进一步降低耐药类器官对MRTX1133的反应（以DAC-30为例），支持该通路在调节药物敏感性中的作用。此外，聚焦干扰素信号下游JAK-STAT通路的代表性组分STAT1和STAT2，在4例耐药类器官系中敲低STAT1或STAT2，各shRNA使靶转录本降低50%以上，敲低任一基因均增加对MRTX1133的耐药。综上，这些结果支持IFNAR1-JAK-STAT轴参与KRAS抑制的固有耐药，并确定其为潜在治疗靶点。

为进一步明确KRAS与IFN信号在固有耐药类器官中的关系，对MRTX1133处理的耐药与敏感组类器官进行多分子层面系统分析。用MRTX1133处理13例PDO系（6例固有耐药和7例敏感）2天后行bulk RNA-seq评估早期转录反应。两组中MRTX1133均诱导KRAS信号下调、IFN-α和IFN-γ信号通路上调，并下调KRAS信号上调（KRAS Signaling Up）和EMT。然而，处理后GSEA显示耐药组干扰素相关信号下调更显著，而MYC相关信号通路（包括MYC靶基因V1和V2、MYC激活通路）在耐药组显著富集。耐药类器官MYC表达及核定位也更高。尽管KRAS信号可调控MYC且KRAS驱动突变可促进MYC扩增和稳定，结果提示耐药类器官中MYC活性受MRTX1133抑制较弱，并促成与耐药相关的转录重编程。MRTX1133处理后ChIP分析显示耐药类器官中MYC结合峰更强更丰富，表明MYC转录活性更高；与敏感类器官相比，MYC对干扰素、JAK-STAT和PRR相关信号基因的结合活性增强，与既往研究一致；并展示耐药与敏感类器官中代表性峰（IFNAR1、IRF2、STAT3、IFNGR1、IRF8和STAT5B）。与之一致，耐药类器官MRTX1133处理后多个固有免疫基因表达相对敏感类器官降低。为功能验证该机制，在耐药（DAC-144）和敏感（DAC-224）类器官中行MYC过表达与敲低实验：MYC过表达抑制免疫反应相关基因及多个下游ISGs表达，MYC敲低则相反；MYC过表达使敏感类器官（DAC-224）产生显著耐药，但不进一步增加固有耐药类器官（DAC-144）的耐药；反之，MYC敲低增加耐药类器官（DAC-144）对MRTX1133的敏感性，对敏感类器官（DAC-224）无显著影响。总之，耐药类器官中MYC活性受KRAS^G12D抑制效果较弱，与固有免疫信号减弱相一致，并可能促成治疗耐药。

体内验证选用3例KRAS^G12D耐药、3例KRAS^G12D敏感和2例KRAS^G12V突变患者来源异种移植（PDX）模型，设四种治疗条件。IFN-β单药对KRAS^G12D耐药PDXs的肿瘤生长影响轻微，MRTX1133在KRAS^G12D敏感PDXs中活性更强；值得注意的是，MRTX1133联合IFN-β显著缩小KRAS^G12D耐药PDXs的终点肿瘤体积。此外，在DAC-178类器官衍生异种移植模型中测试六种治疗条件（溶媒、IFN-β、IFN-γ、MRTX1133、MRTX1133+IFN-β和MRTX1133+IFN-γ），IFN-β和IFN-γ联合MRTX1133均有效减小肿瘤生长。为证明干扰素信号再参与并区分体内抑瘤与杀瘤效应，分析终点收获的DAC-144肿瘤，对增殖（Ki-67）、凋亡（cleaved caspase-3 [CC3]）和干扰素通路激活（IRF9）行IF染色：IFN-β（单用或联合）激活干扰素信号（核IRF9⁺肿瘤细胞）；MRTX1133单用也增加IRF9⁺肿瘤细胞，与既往数据一致；所有治疗均降低Ki-67阳性，以联合组最低；相反，CC3阳性在三个治疗组均显著增加。还对四种条件下的DAC-137异种移植行单细胞RNA测序（scRNA-seq），仅联合组相对溶媒或MRTX1133显示KRAS信号下调特征显著增加；包括IFN-α反应和JAK-STAT信号在内的免疫相关通路在所有治疗组均升高。这些结果证实干扰素通路激活在体外和体内改善对KRAS^G12D靶向治疗的敏感性，提示固有免疫刺激是靶向治疗耐药的潜在治疗策略。

鉴于KRAS^G12D靶向治疗临床获得性耐药的显现，利用体外和体内MRTX1133耐药模型检验固有耐药中鉴定的固有免疫程序是否也参与获得性耐药。体外，将DAC-67类器官暴露于逐渐升高的MRTX1133浓度53天，获得稳定耐药；对敏感与耐药时间点的类器官行bulk RNA-seq。与固有耐药相似，适应性耐药DAC-67类器官固有免疫通路显著下调，包括I型和II型干扰素反应、TNF-α和NF-κB信号及IL-6-JAK-STAT3信号；耐药衍生物MYC激活通路上调、MYC抑制通路下调，提示MYC活性增强，并伴增殖信号增加和凋亡信号减少。体内，在C57BL/6小鼠建立获得性耐药鼠源KPC模型，于治疗反应期（2周）和再生长阶段（1.5个月）取样行scRNA-seq，未检测到明显批次效应，基于标记的聚类鉴定主要细胞类型。肿瘤细胞再聚类显示三个亚簇：亚簇0保持稳定，亚簇1减少，亚簇2在耐药获得过程中扩增。差异表达基因通路富集显示亚簇0富集DNA修复和增殖通路；亚簇1和2均富集MYC相关通路；亚簇1还富集包括干扰素反应在内的固有免疫通路。尽管时间和细胞背景不同，干扰素相关通路在固有耐药与获得性耐药中的趋同提示，共享的免疫逃逸机制可能是跨治疗阶段KRAS^G12D靶向治疗耐药的基础。

讨论部分指出，本研究揭示了胰腺癌KRAS^G12D靶向治疗固有耐药的机制，即干扰素信号抑制介导耐药并与持续MYC活性相关。整合PDOs与患者肿瘤组织的多组学数据表明，干扰素反应受抑的KRAS^G12D胰腺癌亚群对多种RAS抑制剂存在固有耐药；药理学或遗传学激活干扰素通路可降低类器官和PDX模型的耐药，确定干扰素信号是KRAS^G12D抑制反应的关键决定因素。KRAS靶向治疗耐药仍是胰腺癌的关键挑战，KRAS^G12D抑制剂临床试验疗效有限。既往研究聚焦获得性耐药机制，包括二次突变和代偿通路（MAPK、PI3K和YAP）再激活，针对这些通路的联合策略在临床前模型中显示加性效应。本研究则揭示了以干扰素通路转录和表观基因组抑制为特征、无显著基因组改变的原发性细胞内在耐药的新范式；KRAS VAF和分子亚型与耐药不分离，提示干扰素抑制反映表观遗传和转录强制的状态而非遗传异质性。干扰素轴在抗肿瘤免疫中已充分确立，PDAC中KRAS下调ISGs损害细胞内在防御；功能研究显示这种抑制驱动耐药：干扰素抑制赋予对KRAS^G12D抑制剂的耐药，而重新激活以IFNAR1依赖方式使耐药模型重新敏感。独立证据支持药理学激活固有免疫传感器或联合干扰素激动剂可在胰腺癌及其他癌症中诱导抗肿瘤反应。PDOs已成为能够高保真模拟肿瘤异质性和药物反应的强大临床前工具；遗传注释的KRAS^G12D PDO队列结合PDXs，使在细胞、转录和表观遗传水平系统解析耐药机制成为可能，这些模型重现了干扰素通路抑制的普遍性和可逆性，为联合策略的临床前验证提供了必要的转化平台。结论认为，胰腺癌治疗需要双管齐下：强效KRAS抑制剂用于直接细胞毒和肿瘤微环境（TME）调节，以及参与肿瘤细胞内在固有免疫通路；临床前发现提示干扰素信号缺陷可能代表治疗脆弱性，重新激活该通路可能改善对KRAS靶向治疗的敏感性，未来研究应确定将癌基因驱动抑制与固有免疫刺激联合能否改善患者治疗反应。

研究局限性包括：第一，数据将持续MYC活性与耐药肿瘤细胞干扰素通路活性降低相联系，但未确立MYC为内源位点干扰素相关基因的直接转录抑制因子；MYC通常被视为转录放大器，其免疫抑制作用可能通过多种间接机制发生，包括TME重编程或限制固有免疫激活的非经典RNA结合功能，与MYC协同调控该表型的潜在表观遗传辅因子仍待明确。第二，机制研究主要聚焦恶性细胞；虽恶性细胞干扰素信号是耐药的主要预测信号，但非恶性导管、腺泡和基质群体也观察到干扰素活性降低；免疫抑制性PDAC TME反映多种癌基因背景下共享的更广泛机制，多条通路（β-catenin、PI3K和LKB1）强化免疫逃逸；KRAS抑制可重塑TME，增加T细胞浸润、减少免疫抑制性髓系细胞并使巨噬细胞向抗肿瘤表型倾斜，同时增强抗原呈递、IFN-γ信号并降低Tgfb1表达；KRAS^G12D抑制还上调Fas，通过Fas-FasL促进CD8⁺ T细胞细胞毒性；与这些观察一致，耐药肿瘤中的非恶性细胞尽管缺乏KRAS突变或MYC失调，也表现出干扰素活性降低，提示低IFN活性通过旁分泌或微环境重塑延伸至肿瘤细胞之外，促成该状态的细胞间信号和微环境过程尚未直接检验，值得进一步研究。第三，除固有耐药外，初步适应性耐药实验提示长期MRTX1133暴露可能逐步减弱干扰素相关转录程序，这提出获得性与固有耐药共享部分转录特征的可能性，但该适应性表型的机制（包括TME的潜在贡献）仍待明确。最后，缺乏人类临床标本的直接验证；虽然临床前类器官和PDX模型密切模拟人类胰腺癌的许多方面，但缺乏患者样本或临床队列的确认，无法明确建立研究发现的临床相关性；评估KRAS抑制剂与免疫调节剂联合疗效和安全性的前瞻性临床试验将实现最终的患者获益，特别是对KRAS^G12D靶向治疗反应不同的患者临床样本进行多组学分析是重要的未来方向，可能有助于确定与治疗反应相关的肿瘤内在特征。

研究结论部分翻译：本研究揭示了胰腺癌对KRAS^G12D靶向治疗固有耐药的一种机制，其中干扰素信号抑制介导耐药并与持续的MYC活性相关。通过整合PDOs和患者肿瘤组织的多组学数据，研究人员证明，一部分干扰素反应受抑的KRAS^G12D胰腺癌对多种RAS抑制剂存在固有耐药。药理学或遗传学激活干扰素通路可降低类器官和PDX模型的耐药，确定干扰素信号是KRAS^G12D抑制反应的关键决定因素。总之，胰腺癌治疗需要双管齐下的策略：一方面使用强效KRAS抑制剂实现直接细胞毒作用并调节肿瘤微环境（TME），另一方面激活肿瘤细胞内在的固有免疫通路。临床前研究结果提示，干扰素信号缺陷可能代表一种治疗脆弱性，重新激活该通路可能改善对KRAS靶向治疗的敏感性；未来研究应确定将癌基因驱动抑制与固有免疫刺激联合是否能够改善患者的治疗反应。