《Molecules》：Polyphenol Profiling, Antibacterial Activity, and In Vitro Cytotoxic Effects of a Diethyl Ether Fraction from Juniper Cone Berries
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现代药用植物研究旨在拓展其超越传统用途的应用范围。杜松（Juniperus communis L.）球果在皮肤病的植物疗法中具有一定应用背景。本研究对从杜松球果乙醇提取物经顺序溶剂分配获得的二乙醚萃取部位（JC-DEE）进行了考察。采用傅里叶变换红外光谱（FT
现代药用植物研究旨在拓展其超越传统用途的应用范围。杜松（Juniperus communis L.）球果在皮肤病的植物疗法中具有一定应用背景。本研究对从杜松球果乙醇提取物经顺序溶剂分配获得的二乙醚萃取部位（JC-DEE）进行了考察。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）及总酚含量测定进行植物化学表征。评估了JC-DEE的抗菌活性及其对HaCaT角质形成细胞和A375黑色素瘤细胞活力与形态的影响，同时进行了探索性DPPH分光光度法评估。靶向HPLC-MS分析鉴定出11种选定成分，其中7种在验证的校准范围内被定量，芹菜素（apigenin, 1.971 ± 0.150 μg/mL）、原儿茶酸（protocatechuic acid, 1.070 ± 0.049 μg/mL）和木犀草素（luteolin, 0.560 ± 0.046 μg/mL）在分析溶液中浓度最高。抗菌试验显示对所试微生物的抑制效果有限，抑菌圈范围为7至10 mm。探索性DPPH测量揭示了表观吸光度降低随时间与浓度的变化。在细胞试验中，JC-DEE在人A375黑色素瘤细胞和HaCaT角质形成细胞中均产生浓度依赖性的活力降低，估算的IC50值分别为102.7 μg/mL和129.3 μg/mL。相差显微镜观察显示浓度相关的形态学改变，而100 μg/mL浓度下的免疫荧光分析展示了细胞骨架和核的改变，包括核浓缩和碎裂，在A375细胞中尤其可见凋亡小体样结构。总体而言，JC-DEE代表了一个经过植物化学表征的部位，在所研究的细胞模型中表现出有限的抗菌作用和浓度依赖性的细胞毒性，而其抗氧化潜力尚待验证。需进一步研究以确定引起这些效应的成分，阐明细胞死亡的机制，并在其他非恶性细胞模型中评估选择性与安全性。
研究背景
皮肤黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌之一，具有高转移潜力和晚期高死亡率风险。尽管免疫检查点抑制剂和分子靶向治疗等取得了重大进展，但治疗耐药、疾病复发和治疗相关毒性仍是重要的临床挑战。天然产物因其结构多样的生物活性化合物而受到越来越多的关注，这些化合物可能通过调节氧化应激、炎症、凋亡、细胞周期调控、血管生成及肿瘤生长信号通路发挥作用。杜松（Juniperus communis L.）球果在皮肤病传统医学中具有悠久应用历史。已有研究表明，杜松精油和挥发油制备物在多种肿瘤模型中具有抗癌潜力，但其含有大量非挥发性成分，这些复杂混合物需要通过分级分离才能有意义地研究其生物学效应。此前研究人员已证明杜松假果的水溶性部位对A375黑色素瘤细胞具有显著抗增殖作用。基于此，本研究聚焦于同一提取分级流程中获得但尚未表征的二乙醚萃取部位（JC-DEE），旨在比较不同极性部位的组成和生物学特性，探究其植物化学特征、抗菌活性以及对A375人黑色素瘤细胞代谢活性和形态的影响。
主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对干燥的JC-DEE进行官能团表征；采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-QTOF-MS）进行靶向多酚类成分定性与定量分析，使用82种酚类化合物标准品进行外标法定量；通过Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量（TPC）；使用DPPH分光光度法进行探索性抗氧化评估；采用纸片扩散法评价抗菌活性，受试微生物包括金黄色葡萄球菌ATCC 25923、化脓性链球菌ATCC 19615、大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和近平滑念珠菌ATCC 22019；利用Alamar Blue法检测细胞活力，在HaCaT永生化人角质形成细胞和A375人恶性黑色素瘤细胞中进行；采用免疫荧光显微术分析细胞骨架（β-肌动蛋白）和核形态（Hoechst 33342染色）。
研究结果
3.1 HPLC-MS多酚植物化学成分分析：靶向HPLC-MS分析鉴定出11种目标化合物，其中7种在验证的校准范围内定量。芹菜素（apigenin, 1.971 ± 0.150 μg/mL）浓度最高，其次为原儿茶酸（protocatechuic acid, 1.070 ± 0.049 μg/mL）和木犀草素（luteolin, 0.560 ± 0.046 μg/mL）。芹菜素-7-葡萄糖苷（apigenin-7-glucoside, 0.266 ± 0.023 μg/mL）、香草酸（vanillic acid）、对香豆酸（p-coumaric acid）和伞形酮（umbelliferone）也被定量。没食子酸（gallic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）和金合欢素（acacetin）低于定量限（LOQ）。结果表明JC-DEE主要以芹菜素、原儿茶酸和木犀草素为特征。
3.2 总酚含量：JC-DEE的总酚含量为114.22 ± 5.35 mg绿原酸当量（CAE）/g提取物。与先前研究的同一杜松提取物的其他部位相比，JC-DEE的酚含量处于中等水平，高于正丁醇部位（104.73 ± 10.03 mg CAE/g）和水部位（70.75 ± 8.80 mg CAE/g），但远低于乙酸乙酯部位（361.08 ± 17.72 mg CAE/g）。
3.3 FTIR光谱：FTIR光谱显示在2933.73 cm-1（脂肪族C-H伸缩）和1697.36 cm-1（羰基伸缩）处有强吸收峰，3431.36 cm-1宽峰符合O-H伸缩，1508.33 cm-1带符合芳香环振动。整体FTIR图谱支持羟基化、含羰基和芳香族成分的存在，与HPLC-MS鉴定的酚类化合物一致。
3.4 探索性DPPH分光光度观测：由于方法学限制（未匹配的对照和缺乏样品空白），所得响应仅为表观吸光度降低指数而非验证的自由基清除活性。初始测量（5 s）时表观吸光度降低值为26.17%-28.36%，无一致浓度依赖性模式；1200 s时为28.11%-35.95%，随浓度增加呈升高趋势。这些数据不能用于量化抗氧化效力。
3.5 抗菌活性：JC-DEE在纸片扩散条件下显示出可测量的抗菌活性，但对所有测试微生物的抑菌圈均未超过预设的15 mm筛选阈值，因此未进行最低抑菌浓度（MIC）测定。最大抑菌圈见于化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌（10 mm），其次为大肠杆菌和铜绿假单胞菌（8 mm），近平滑念珠菌最小（7 mm）。
3.6 对细胞活力的影响：Alamar Blue法检测显示，JC-DEE在两种细胞系中均产生浓度依赖性的活力降低。在HaCaT细胞中，从50 μg/mL开始观察到显著活力下降，200和300 μg/mL时活力分别降至28.44 ± 3.1%和11.56 ± 7.3%。A375黑色素瘤细胞呈现相似反应，200和300 μg/mL时活力分别降至16.20 ± 7.8%和5.79 ± 3.1%。非线性回归估算的IC50值：A375细胞为102.7 μg/mL（95% CI: 67.9-155.1 μg/mL），HaCaT细胞为129.3 μg/mL（95% CI: 68-247 μg/mL），差异有限，不表明选择性抗黑色素瘤活性。
3.7 细胞形态学：相差显微镜观察显示，JC-DEE处理导致HaCaT和A375细胞出现细胞变圆、贴壁丧失、脱落和密度降低等形态学改变，且在A375细胞中更为明显。免疫荧光分析（100 μg/mL）显示，HaCaT细胞中β-肌动蛋白组织相对完整，偶见核浓缩和碎裂；而在A375细胞中则观察到明显的细胞骨架重组和正常细胞结构丧失，核改变包括染色质浓缩、核收缩和碎裂，伴有凋亡小体样结构。
讨论与结论
讨论部分指出，JC-DEE的FTIR图谱与含脂肪族、含氧官能团和不饱和成分的混合物一致。靶向HPLC-MS分析确定的芹菜素、原儿茶酸和木犀草素与既往杜松果实多酚研究结果相符。JC-DEE的总酚含量为114.22 mg CAE/g，介于其他极性部位之间。探索性DPPH实验因方法学缺陷无法确认抗氧化活性。抗菌评估显示有限抑菌效果，可能与成分溶解度和扩散特性有关。细胞活力实验表明JC-DEE在两种细胞系中均产生浓度依赖性细胞毒性，但IC50值接近，提示选择性有限。虽然芹菜素、木犀草素等单个成分已知具有抗黑色素瘤活性，但它们在JC-DEE中的浓度较低，观察到的细胞毒效应可能是多成分共同作用的结果。免疫荧光显示的核形态学改变与凋亡特征一致，但不能独立确认凋亡。
研究结论：本研究提供了杜松球果二乙醚萃取部位（JC-DEE）的综合植物化学和生物学表征。靶向HPLC-MS分析确定了芹菜素、原儿茶酸和木犀草素为定量分析物中最丰富的化合物，此外还有若干其他酚酸和黄酮衍生物。JC-DEE在所采用的纸片扩散条件下对测试微生物产生有限的生长抑制。尽管探索性DPPH测量显示了表观分光光度响应，但其方法学局限性阻碍了对该部位自由基清除活性的验证。这些发现有助于阐明该部位的植物化学组成和生物学特性。细胞实验揭示JC-DEE以浓度依赖性方式降低A375细胞的代谢活性，并伴随显著的形态学、细胞骨架和核改变。类似的效应也在HaCaT角质形成细胞中观察到。尽管其中一些改变提示JC-DEE诱导了凋亡样形态学变化，但仍需进一步的生化和分子试验来确认潜在的细胞死亡机制。总体而言，这些发现为JC-DEE在既定细胞模型中的体外细胞毒效应提供了初步证据。未来研究应阐明其主要植物化学成分的贡献，建立其细胞效应的机制，并在其他对应的非恶性细胞中评估其细胞毒性选择性。还需采用适当对照和验证过的抗氧化试验进行进一步研究，以确定JC-DEE的植物化学组成是否能转化为可测量的自由基清除活性。
