## 基于多产地和商业来源的临床相关圣罗勒（Ocimum tenuiflorum）提取物的植物化学、抗氧化与化学计量学综合评价

《Molecules》：Integrated Phytochemical, Antioxidant, and Chemometric Evaluation of Clinically Relevant Ocimum tenuiflorum Extracts from Diverse Geo-Climatic Regions

　　

摘要

背景/目的：圣罗勒（Ocimum tenuiflorum，OT）表现出多种与抗氧化活性相关的治疗效应。整合植物化学变异性、功能性抗氧化成分定位以及药典相关提取物（Pharmacopeia-Relevant Extracts，PREs）化学计量学评价的研究仍较为有限。本研究考察了来自不同地理气候区域及商业来源的OT的PREs之间的植物化学变异性及抗氧化相关特征谱。方法：采用高效薄层色谱（High-Performance Thin-Layer Chromatography，HPTLC）指纹图谱、HPTLC-2,2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）生物自显影、HPTLC定量、总酚与总黄酮含量（Total Phenolic and Flavonoid Content，TPC与TFC）、DPPH-IC₅₀与铁还原抗氧化能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，FRAP）测定、相关性统计及化学计量学分析对PREs进行研究。结果：所有PREs中均检出迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）与熊果酸（Ursolic acid，UA）；丁香酚未检出，但在非极性提取物中检出。HPTLC-DPPH生物自显影显示RA具有抗氧化相关定位，而UA无此表现。RA浓度、TPC、TFC、DPPH-IC₅₀及FRAP在PREs间呈现显著变异。RA较TPC与抗氧化终点的相关性更强：与FRAP呈正相关，与DPPH-IC₅₀呈负相关；TFC与数据集的相关性不显著。地理气候变异性与RA、TPC、IC₅₀及FRAP的差异相关，而TFC未达显著性，品种间差异亦不显著。化学计量学分析显示PREs间具有可区分的聚类。结论：本研究揭示了地理气候所致植物化学变异的观察性趋势，并在当前条件下确认RA为主要抗氧化相关标志物。

研究背景方面，药用植物至今仍是治疗性物质的重要来源之一，然而现代医疗体系因起效迅速、标准化简便、剂量精确及临床验证可重复等优势，日益由植物来源治疗转向分离天然产物与合成药物。与合成或分离化合物不同，植物基制剂的最终化学组成高度依赖其生长条件，即农业气候条件、土壤特性、农业胁迫因素、植株年龄与季节变化，且采后处理与贮藏深刻影响次生代谢谱，致使同一植物物种制备的同一制剂有时差异明显。工业环境中的药材常来自生长条件差异显著的不同地理区域，并伴随有时难以控制的供应链，使异质性进一步加剧，从而增加临床疗效验证的复杂性。草药来源、标准化、质量控制与质量保证因其极度复杂的本质而固有困难，即使今日仍难以实现草药制剂的完全表征。为此，草药标准化常依赖生物活性化合物及酚类、黄酮类、皂苷等主要次生代谢物的定量，并通过同时比较多个样品以评估可能的偏差。此外，主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、线性判别分析、支持向量机与随机森林分类等先进化学计量学与机器学习方法被用于处理复杂多变量数据，实现统计区分、特征提取与异质样品的稳健化学表征。尽管已有相当努力应对这种多样性与异质性，涉及实际应用场景的研究仍有限甚至罕见，尤其是涉及与药典制备相关或接近的提取物的研究。现有研究多每地仅一个样品，或多来自单一地点或邻近地区；且主要采用内部控制的来源与严格标准化的采后处理；多使用实验室定义的植物提取物而非源自植物原料的、与药典一致的提取物。除技术障碍外，草药产业还面临去中心化采购网络带来的社会经济与物流挑战，使统一栽培、标准化采后处理与完全可追溯供应链在现实条件下难以维持，这些不受监管的农业与加工差异引入未测量的农业胁迫与植物化学不一致。因此，研究人员设想，对来自不同地理区域、由分类学鉴定样品与商业来源样品共同组成的药典相关制剂进行植物化学变异性的比较定量评价，或可为迈向稳健草药标准化奠定实用策略基础。常规草药质量控制涉及灰分值、浸出物值、pH、紫外-可见（Ultraviolet–Visible，UV–VIS）光谱、TPC、TFC、薄层色谱（Thin-Layer Chromatography，TLC）、HPTLC指纹图谱等，但这些仅提供初步信息，无法捕捉其重要内涵；而气相色谱-串联质谱（Gas Chromatography–Tandem Mass Spectrometry，GC–MS/MS）与液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry，LC–MS/MS）等广谱非靶向代谢物分析虽具探索性，可用于初步靶标识别并通常提供暂定推定的化学谱，但需通过正交结构确证或分离纯化化合物的表征加以验证。因此，鉴于草药样品的固有异质性，将深入分析研究与化学计量学建模结合以实现超越定性观察的更全面植物化学谱分析具有重要意义。OT（曾称Ocimum sanctum L.）或称圣罗勒，是东南亚尤其是印度最重要的药用植物之一，其巨大药用价值具有深厚文化意义，在印度被尊为"生命万灵药"。其意义超越传统与民族药用，现代植物药研究已认识其多种生物学益处，研究揭示其广谱药理潜力，包括显著抗菌、抗炎、抗癌、抗糖尿病与免疫调节活性，并显示突出的心脏、肝脏、神经与肾脏保护作用。值得注意的是，OT的核心作用机制似源于其抗氧化活性，成为其多种生物活性统一的通路。近期研究提示，其抗炎、抗癌、保肝、护心与神经保护效应与氧化应激相关，包括活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）生成/清除、脂质过氧化与内源性抗氧化防御机制。鉴于其药用意义，已有多项研究试图将各种化学参数与其抗氧化效应相关联：Agarwal等发现OT与Ocimum kilimandscharicum乙酸乙酯提取物的抗氧化特性，并通过高效液相色谱/液相色谱-质谱（High-Performance Liquid Chromatography/Liquid Chromatography–Mass Spectrometry，HPLC/LC–MS）暂定鉴定RA、咖啡酸及其他咖啡酸衍生物，但每种仅一个样品，研究本质为观察性；Tomar等类似地将OT与Ocimum gratissimum L.精油的抗氧化潜力相关联，同样每种仅一个样品；Saelao等通过化学计量学分析全面关联抗氧化特性与酚类、花青素及黄酮类等主要次生代谢物类别，但局限于类别水平的植物化学评估，缺乏对抗氧化活性成分的直接功能检测；Chaudhary等主要结果与Saelao等相似，黄酮与酚含量高的提取物组分显示更高抗氧化特性；近期整合代谢组学与化学计量学研究揭示了罗勒属物种的植物化学变异性与多变量区分。然而许多现有研究仍缺乏全面分离、正交结构确证及特定植物化学标志物的直接功能评价，尤其是与药典相关提取条件下抗氧化活性相关者。为弥补现有研究空白，本研究对依据药典标准制备、来源于不同地理区域及商业来源植物样品的OT酊剂进行化学标志物谱分析与鉴定。选择该特定药典因其遵循单植物基酊剂制备，为目标分析验证提供科学一致的框架，避免多草药配方的复杂性。比较HPTLC指纹图谱鉴定RA与UA为普遍存在的标志物，RA在HPTLC-DPPH测定中显示强自由基清除特征并经正交结构表征确证；采用经验证的HPTLC法定量RA，通过DPPH与FRAP测定评价抗氧化能力；经TPC与TFC监测植物化学变异性；对这些植物化学与抗氧化参数进行统计相关分析，并进一步考察地理与品种影响；通过化学计量学分析评估所得模式，以评价所研究地理气候区域间的样品聚类。

研究人员开展了如下研究。共考察13个PREs：9个野外采集样品（以其采收凭证田间编号标识）与4个商业来源样品（MR1、MR2、MR3与MR4）。所有13个样品无论来源均由作者之一J.S.鉴定。按药典以地上部分（全株除根）用76%（v/v）含水乙醇，按药材重量与溶剂体积比1:10于25 °C浸渍14天制备酊剂，过滤后于0–4 °C避光保存。结果方面，2.1 植物化学标准标志物筛选与抗氧化相关标志物检测：采用HPTLC指纹图谱筛选RA、UA与丁香酚。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸5:4:1（v/v/v）在极性区获得良好分离并检出RA，以己烷-乙酸乙酯4:1（v/v）在非极性区良好分离并检出UA。全部13个PREs中一致存在RA与UA。然而，OT已知生物活性成分丁香酚在PREs中未能经HPTLC检出，而10876原料的戊烷与二氯甲烷（dichloromethane，DCM）提取物经类似制备后显示其大量存在，提示药典相关提取体系内存在提取选择性的植物化学分配，与丁香酚的亲脂性及其精油中为主要成分（32–35%）的近期GC–MS研究一致。HPTLC-DPPH测定中RA显示强DPPH自由基清除活性，UA即使以纯品测定亦无可检出抗氧化活性；除RA外PREs还观察到额外漂白活性区带，表明其他抗氧化成分亦参与总体自由基清除谱。2.2 分子对接研究：初步对接显示RA较UA具相对更高结合亲和力；强调这些计算评分并不确认体外或体内疗效，仅作为与HPTLC-DPPH观察并列的补充理论支持以在RA与UA间选择更重要标志物，该类结果促使选择RA作为后续定量与化学计量学研究的主要标志物。2.3 RA的定量与表征：采用HPTLC光密度法于325 nm、R_f≈0.30定量。RA浓度从14.54 ± 0.07 μg/mL（11009）至169.40 ± 0.58 μg/mL（MR4）；Indus Plain/Semi-Arid（I）区其他样品11114与11118分别达97.81 ± 0.30与149.00 ± 2.10 μg/mL；最低者11009为Western Ghats（W）样品，另两个W样品10612与11018分别为28.82 ± 0.29与35.07 ± 0.23 μg/mL。方法经LOD、LOQ、线性、日内与日间精密度、回收率与稳健性验证：RA线性范围250–600 ng，R² > 0.99；LOD与LOQ分别为38.85 ng与117.73 ng；因基质化学复杂性，日内（n = 3）与日间（n = 3）分析采用PRE本身而非标准品；回收率在±2%内；饱和时间改变±20%、展开长度改变±12.5%时R_f未见明显变化；溶剂系统改为5.2:3.8:1与4.8:4.2:1（v/v/v）时R_f分别为0.29与0.33且不影响斑点纯度，表明方法稳健；日内与日间%RSD/%CV均约为0.5。RA并经HRMS（?ESI）、¹³C-NMR与¹H-NMR与文献数据比较正交确证。2.4 总酚与总黄酮含量：分别采用Folin-Ciocalteu与氯化铝比色法，标准曲线线性相关系数均超过0.99（TPC：0.995；TFC：0.999）。TPC范围为0.64 ± 0.048 mg GAE/mL（11009）至2.45 ± 0.008 mg GAE/mL（MR4），TFC范围为0.63 ± 0.009 mg QE/mL（10612）至3.60 ± 0.020 mg QE/mL（MR3）。三个I区样品（11114、11118与MR4）连同10876显示同步高的RA浓度与总体较高的TPC，而TFC无此观察，如MR3虽RA浓度仅中等却显示最高TFC。2.5 DPPH自由基清除活性：通过对同一体积系列稀释PREs（10至10,240倍稀释）测定抑制率而非单点测定，获得稳健全面的抗氧化谱，结果IC₅₀介于0.0061 ± 0.0015与0.0719 ± 0.0013 mg/mL之间，即超过10倍变异；11118清除活性最强，其次MR4，11009最低；抗坏血酸IC₅₀为0.0112 mg/mL，11118与MR4按质量计IC₅₀低于抗坏血酸，其增强活性可能源于HPTLC-DPPH生物自显影中与RA同时检出的多种抗氧化成分的加和贡献。2.6 FRAP：FRAP值范围为0.48 ± 0.009至1.97 ± 0.033 mg Trolox当量（Trolox Equivalent，TE）/mL，亦呈显著变异，但最高与最低值差异约四倍，此类比较应结合实验设计与氧化还原机制差异谨慎解读；总体DPPH抑制实验得到FRAP测定的佐证，显示PREs间一致的抗氧化行为；I区显示高FRAP值（1.51 ± 0.035至1.97 ± 0.033 mg TE/mL），而W区样品值持续较低（0.48 ± 0.009至0.83 ± 0.003 mg TE/mL）。2.7 PREs的整合植物化学与抗氧化谱：通过排序平均RA浓度、TPC、TFC、IC₅₀与FRAP值进行整合比较，括号内数值指明该PRE在相应参数上的排名，IC₅₀排名1代表最低值，其他参数值越高排名越高；排名显示均值顺序，但相邻排名不必然代表样品间统计学显著差异（如单因素方差分析与Tukey HSD事后检验所示）。11118总体抗氧化谱最佳，FRAP活性最高（排名1）、IC₅₀最低（排名1），RA浓度排名2、TPC与TFC排名3；同属I区的商业样品MR4 RA浓度与TPC最高，FRAP与IC₅₀排名2，但TFC为最低之一（排名12）；11009在RA浓度、TPC与IC₅₀排名最低（排名13），FRAP排名倒数第二（排名12），而TFC排名中等（第7）；10876在RA浓度、TPC、TFC、IC₅₀与FRAP的排名分别为4、2、2、4与5，总体排名一致。Tukey HSD显示部分相邻排名无显著差异，IC₅₀尤为明显，四个样品构成统计学不可区分组，故排名应视为总体趋势而非精确两两差异。定性上排名提示RA浓度、TPC、IC₅₀与FRAP存在一定相关，而TFC相关可能较弱或缺失，数据亦提示地理对这些参数的影响，但排名非单调，需统计分析检验其显著性。2.8 植物化学参数与抗氧化活性间的相关性分析：Shapiro–Wilk分析表明仅RA浓度显著偏离正态分布（W = 0.855，p = 0.033），TPC、TFC、IC₅₀与FRAP的p值均> 0.05。Pearson与Spearman分析显示：RA浓度与TPC正相关（Pearson r = 0.748，p = 0.003；Spearman ρ = 0.692，p = 0.009）；RA浓度与FRAP显著正相关（r = 0.803，p = 0.001；ρ = 0.806，p = 0.001）；RA浓度与IC₅₀显著负相关（r = ?0.642，p = 0.018；ρ = ?0.648，p = 0.017）；TPC与IC₅₀显著负相关（r = ?0.596，p = 0.032；ρ = ?0.676，p = 0.011）；TPC与FRAP显著正相关（r = 0.571，p = 0.041；ρ = 0.652，p = 0.016）；TFC与RA浓度、TPC、IC₅₀与FRAP相关性相对较弱且不显著，尽管与IC₅₀似有中等趋势；IC₅₀与FRAP呈强负相关（r = ?0.777，p = 0.002；ρ = ?0.806，p = 0.001）。在两个抗氧化终点上，RA浓度均较TPC显示更强关联，系数绝对值更高、p值更低，Spearman分析呈相同排序，表明该差异并非分布假设所致。总体表明RA浓度、TPC与抗氧化行为间存在统计学显著相关，凸显RA为重要抗氧化标志物，而TFC关联较弱且不显著。作为考虑来源未经验证商业样品的对照，以9个具凭证认证的野外采集样品重复相关分析，该子集所有参数近似正态分布（Shapiro–Wilk，p > 0.05），全部核心关联得以保留甚至增强（RA vs TPC：r = 0.762，p = 0.017；RA vs IC₅₀：r = ?0.756，p = 0.019；RA vs FRAP：r = 0.963，p < 0.001；TPC vs IC₅₀：r = ?0.746，p = 0.021；TPC vs FRAP：r = 0.719，p = 0.029；IC₅₀ vs FRAP：r = ?0.768，p = 0.016），表明这些发现反映真实的植物学趋势。2.9 地理气候变异与品种效应对植物化学与抗氧化参数的影响：对近似正态分布的TPC、TFC、IC₅₀与FRAP行单因素方差分析，对偏离正态分布的RA浓度行Kruskal–Wallis（KW）分析。RA浓度KW p值为0.0332 < 0.05，提示统计学显著关联；TPC、TFC、IC₅₀与FRAP的单因素方差分析p值分别为0.039、0.078、0.012与0.017，表明TPC、IC₅₀与FRAP关联显著而TFC不显著；效应量计算显示全部五个参数均呈大关联（η²/ε² = 0.61–0.87），包括TFC（η² = 0.61），与各区域n = 2–3时统计功效有限一致，而非地理气候影响真正缺失，此与2.10的独立化学计量学聚类相互印证。箱线图显示RA浓度、TPC、IC₅₀与FRAP明显的地理气候间变异；I区PREs RA浓度较高且抗氧化相关行为较强，W区最低。然而Krishna品种在各植物化学与抗氧化参数上的品种差异均不显著（p > 0.05）。综上提示地理及相关环境因素可能较所研究品种分类对植物化学变异性贡献更大：地理气候区显示大效应（η²/ε² = 0.61–0.87），而品种显示可忽略至小效应（η²/ε² = 0.00–0.03）。2.10 化学计量学评价：PCA、层次聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）、树状图分析与热图生成显示可观察的聚类。PCA碎石图显示PC1（Dimension 1）与PC2（Dimension 2）合计解释总变异的85.0%，其中PC1贡献62.67%、PC2贡献22.32%；得分图显示多个PREs具明显聚类倾向，RA浓度、TPC与FRAP活性较高且IC₅₀较低者聚集于PC1正侧，11118与MR4聚类行为较接近，而RA浓度与抗氧化效应较低的10612与11009分布于PC1负侧。热图显示RA浓度、TPC与FRAP活性高且IC₅₀低的PREs呈聚类模式，而TFC相对抗氧化行为的聚类不一致；热图亦显示RA浓度的地理依赖性聚类行为；树状图显示多个地理相关PREs间密切的层次关系，如I区三个样品中的两个（11118与MR4）因高RA浓度、TPC与强抗氧化效应紧密聚类，最有趣的是若干市场样品与其同地理区域的野外样品紧密聚类。

技术方法方面，研究人员主要采用：HPTLC指纹图谱与光谱匹配（配合ASR、NP/PEG与三氯化铁衍生化及光密度扫描）；HPTLC-DPPH生物自显影定位抗氧化活性成分；经ICH Q2(R1)验证的HPTLC定量法测定RA（325 nm）；Folin-Ciocalteu法测TPC、氯化铝比色法测TFC；基于系列稀释与四参数逻辑（Four-Parameter Logistic，4PL）非线性回归的DPPH-IC₅₀测定及FRAP测定；分离纯化RA并以HRMS与NMR正交确证；此外进行Pearson/Spearman相关分析、Monte Carlo置换检验、单因素方差分析、Tukey HSD、Kruskal–Wallis、效应量计算，以及PCA与基于欧氏距离与Ward D2法的HCA，并以LeDock开展分子对接。样本队列来源为印度5个地理气候区（W、E、D、G、I）的9个凭证认证野外采集样品及4个商业来源样品（MR1–MR4），凭证标本存于Survey of Medicinal Plants and Research Garden for Homoeopathy（SMPRGH）标本馆。

讨论部分指出，既往OT与罗勒属研究虽报道了抗氧化活性、色谱指纹图谱、代谢组学表征与化学计量学聚类，但许多局限于一般代谢物水平评估且地理采样极其有限；与主要采用串联质谱的高端代谢组学研究不同，本研究不仅纳入并整合了多种正交分析技术，包括经HPTLC-DPPH定位抗氧化相关成分RA、HPTLC定量RA及定量TPC与TFC等不同植物化学实体，以功能性地将其与DPPH清除分析与FRAP所显示的抗氧化效应相衔接；但 arguably 最重要之处在于研究临床相关提取物而非实验室定制的、常缺乏转化相关性的提取物。本研究中RA在HPTLC板上显示突出的DPPH响应性抗氧化定位，而UA在相同条件下无可检出抗氧化活性；由于色谱图中检出若干未鉴定条带（包括HPTLC-DPPH生物自显影中检出的具抗氧化效应的条带），未来研究有必要进一步考察，全面鉴定每个条带需从板上洗脱个别条带继而进行直接MS/MS分析并结合离子迁移谱，超出本药典基础靶向分析验证研究的范围，此类非靶向代谢物谱分析被列为未来工作方向。该观察提示RA较UA更显著地贡献于所有PREs所显示的抗氧化特性，化学上这些抗氧化特性可能源于RA的多酚性质，与既往报道的富含RA的罗勒提取物抗氧化关联相符，然而多数此类抗氧化研究主要涉及提取物的总体抗氧化效应。近期关于OT植物化学的综述亦指出RA为重要抗氧化相关成分，与UA并列；该综述未发现RA相关显著毒性，而UA被报道有肝毒性，此差异亦支持选择RA而非UA作为标准化标志物。RA通过其邻苯二酚基团清除自由基并结合Fe²⁺与Cu²⁺等金属离子，亦被报道通过Nrf2通路增强机体抗氧化防御，这些结果与本研究中HPTLC-DPPH生物自显影所观察到的RA直接抗氧化活性基本一致，故此处观察到的抗氧化活性连同RA已报道的安全性特征，为在用于临床的药典相关提取物中选择RA而非UA作为标准化标志物提供了科学依据。分子对接结果与既往RA的计算机研究平行，其中RA与抗癌相关受体MARK4、FAK与HSP90AA1显示良好结合，该报道研究与本研究的计算机发现提示RA可能作为多靶点生物活性化合物；RA在OT中已报道的抗氧化、抗炎、抗癌与认知保护活性也与本研究对接所考察的活性类别相符。对接结果为选择RA而非UA提供了额外但纯属理论的支持，RA在所有七个评价的蛋白靶标中一致显示较UA更强的结合亲和力，然而该分析纯属计算且未经实验验证，故被视为支持性而非确凿证据。初步指纹图谱与标志物鉴定研究表明丁香酚未能经HPTLC在PREs中确证检出，而同时可在植物材料的戊烷与二氯甲烷提取物中轻易检出，这与溶剂性质与极性对代谢分配的作用一致。本研究中观察到RA浓度、TPC、TFC、IC₅₀与FRAP的相当大变异，与既往报道一致。RA浓度、TPC与FRAP间统计学显著正相关及与DPPH IC₅₀值的负相关，提示RA浓度与TPC对所研究PREs抗氧化谱的实质贡献；尽管RA浓度在技术上属于TPC的一部分，但RA浓度较TPC与抗氧化参数相关性更强，表明在本研究条件下RA浓度较TPC更密切追踪抗氧化行为。然而TFC与抗氧化参数DPPH-IC₅₀和FRAP相关性统计学不显著，提示抗氧化特性可能更强烈地与特定酚类成分尤其是RA而非TFC相关联，至少在目前实验条件下如此，尽管TFC与IC₅₀间存在轻度反向趋势。以摩尔为基础，TFC（2.08–11.90 μmol/mL QE）与TPC（3.76–14.40 μmol/mL GAE）覆盖相当且重叠的范围，表明TFC含量相对TPC并未不成比例地低；TFC在数据集上的%RSD（44.9%）也高于TPC（39.2%）与FRAP（38.5%），排除了低变异性作为解释；此外全部十对相关性的Monte Carlo置换检验显示四个TFC相关关联仍显著不显著（p = 0.21–0.67），而其余六个保持显著，包括若干p值更低者；这些发现提示TFC与抗氧化活性的弱关联并非由于其低含量或统计假象，而可能反映测定特异性敏感性或与RA驱动的抗氧化信号的组成独立性。箱线图清楚显示I区样品相对W区样品在RA浓度、TPC、DPPH IC₅₀与FRAP值上存在明显差异，表现为其独特且对角分离的聚类模式。PCA聚类、热图与树状图分析表明PREs间具可区分的植物化学-抗氧化模式，罗勒属物种及OT栽培品种间类似化学计量学区分已有报道；有趣的是，若干商业获得样品显示与其相应地理气候区来源的野外样品（如MR4与11118、MR3与10876、MR1与10835）聚类相似，尽管这些商业样品缺乏直接来源可追溯性。尽管如此，本研究仍存在若干局限。首先所用抗氧化测定主要属化学性质，若无进一步生物学验证研究则不易直接转化为生物学推断，但相信本研究可为未来涉及具多样植物化学特征提取物的生物学研究奠定基础；同样，分子对接结果具探索性，不应被解读为实际生物靶标结合或体内活性的证据。另一限制解释的重要因素是，尽管关联具统计学显著性，所观察到的地理效应可能部分与季节、环境、农业及采后干预相纠缠；由于本研究固有性质，尤其纳入采集与处理历史未知的商业样品，加之各区域子集内样本量相对较小，此类纠缠无法有效解决。为应对该可能问题，仅以9个凭证认证样品（排除商业来源提取物）重复相关分析，六个统计学显著相关性不仅得以保留且有时增强，支持所观察关系反映固有植物学趋势而非商业样品纳入假象。然而，商业样品与来源相似地理区域野外样品的聚类凸显了有意义的观察性趋势，指向潜在地理影响，为未来靶向研究提供了有价值的初步见解。五个地理气候区样品跨越印度广阔地理范围，两个最远采样点相距约1600 km，涵盖差异显著的气候与土壤条件；样本量由野外植物自然可得性而非预定目标决定。为独立于样本量评估这些趋势计算了效应量，揭示地理气候区的大效应（η²/ε² = 0.61–0.87）与品种的可忽略效应（η²/ε² = 0.00–0.03）。尽管RA在所研究PREs中成为关键抗氧化相关成分，考虑这些制剂在临床实践中的相关性，仍需进一步多学科研究评估所观察化学变异性如何影响其生物活性谱。总体而言，本研究提示RA在临床相关提取物中代表突出的抗氧化相关植物化学标志物，贡献于所观察的总体抗氧化活性；研究进一步凸显显著的地理气候相关植物化学变异性，并强调直接在临床相关提取物中通过正交确证评价植物化学标志物的重要性，而非仅依赖探索性溶剂提取物或非靶向代谢组学谱分析。

结论部分译文为：本研究证明，来自印度五个不同地理气候区域及商业来源的OT的PREs在植物化学与抗氧化相关特征上存在显著变异。HPTLC指纹图谱在所研究全部PREs中一致鉴定出RA与UA。然而，HPTLC-DPPH生物自显影测定显示RA具突出抗氧化活性定位并伴有其他未鉴定斑点，而UA无可检出活性。此外，尽管丁香酚在非极性提取物中易于检出，但在由完全相同的原料药制备的PREs中无法确证检出，凸显提取溶剂极性对植物化学分配的重要影响。连同亦指向相对更高抗氧化相关与受体结合潜力的探索性对接研究，这些发现促使选择RA作为后续定量与化学计量学研究的主要标志物。对13个PREs的定量HPTLC分析显示RA浓度在PREs间存在相当异质性。RA浓度、TPC与FRAP活性间的正相关及与DPPH基IC₅₀值的反向关联，提示RA与总体酚类对当前实验条件下所研究PREs抗氧化相关行为的潜在作用。然而，值得注意的是，RA浓度成为与所研究PREs抗氧化行为关联更强的参数，在幅度与统计强度上均超过TPC。当分析仅限野外采集、凭证认证样品而排除全部商业来源提取物时，这些关联保持稳健，强化了所观察关系反映真实植物学趋势。相反，TFC在全数据集内与抗氧化参数显示相对较弱且统计学不显著的关联。地理气候变异显示所研究PREs间RA浓度、TPC、IC₅₀与FRAP的统计学显著变异；相反，品种差异在这些指标上统计学不显著。效应量估计进一步支持该区别，地理气候关联显示一致的大幅度，而品种关联为可忽略值。在此样本分布限制内，这提示地理气候差异可能较本研究所考察的表型分类对植物化学与抗氧化差异贡献更大，为未来样本量扩大且更均衡的研究探索提供了基础框架。PCA、层次聚类、树状图与热图等化学计量学分析观察到PREs间可区分的聚类倾向。值得注意的是，尽管商业样品缺乏直接栽培可追溯性而仅按其采购区域分类，其仍与来自相应区域的认证野外样品显示聚类相似，该观察提示这些市场样品可能为当地种植，呈现值得未来系统研究的趋势。最终，本研究强调将抗氧化相关定位、总体抗氧化评价、正交植物化学表征与化学计量学分析直接整合于临床与药典相关提取物中，对改进植物化学评估及草药来源、生产与标准化的重要意义。