《Molecules》：Development and Characterization of a Zanthoxylum limonella Essential Oil Nanoemulsion for Oral Care Applications
编辑推荐：
本研究旨在表征由新鲜与阴干果实提取的Zanthoxylum limonella精油（ZLO）的化学组成，并开发纳米乳以提升其在口腔护理产品中的稳定性与适用性。新鲜与阴干果实精油经水蒸气蒸馏法（hydrodistillation）获得，并采用气相色谱–质谱联用技
本研究旨在表征由新鲜与阴干果实提取的Zanthoxylum limonella精油（ZLO）的化学组成，并开发纳米乳以提升其在口腔护理产品中的稳定性与适用性。新鲜与阴干果实精油经水蒸气蒸馏法（hydrodistillation）获得，并采用气相色谱–质谱联用技术（GC–MS）分析。干燥果实精油的主要挥发性成分为柠檬烯（limonene，34.84%）、萜品烯-4-醇（terpinen-4-ol，15.75%）、桧烯（sabinene，11.02%）、α-水芹烯（α-Phellandrene，7.10%）、顺式-β-罗勒烯（cis-β-Ocimene，4.74%）与γ-萜品烯（γ-Terpinene，4.52%）。干燥显著改变了精油的化学组成，导致α-水芹烯（19.75%降至7.10%）、β-月桂烯（β-myrcene，3.54%降至2.16%）与芳樟醇（linalool，2.88%降至1.78%）的相对丰度明显下降，而柠檬烯（29.52%升至34.84%）与萜品烯-4-醇（4.44%升至15.75%）的相对百分比显著升高。以亲水亲油平衡值（HLB）为12.0–15.0、浓度为20–26%的优化混合表面活性剂体系，开发了含干燥果实精油的水包油型（oil-in-water）纳米乳（NE-ZLO）。对11种纳米乳配方（NE-ZLO-1至NE-ZLO-11）的液滴粒径、多分散指数（PDI）与Zeta电位进行了表征。NE-ZLO-9在所需表面活性剂浓度最低的情况下表现出最有利的理化性质。其在冷藏（4 °C）、常温、加速（45 °C）与光照暴露条件下的稳定性，与游离精油（ZLO）进行了比较评估。在贮藏期间，NE-ZLO-9的表观柠檬烯当量保留率高于游离ZLO，尤其在加速与连续光照暴露条件下更为明显。将其掺入口腔护理原型产品后，纳米包封的优势在漱口水中更为突出，而牙膏基质本身对挥发性成分的损失提供了显著保护。上述结果表明，纳米包封与配方基质是贮藏期间保护ZLO的重要因素，并支持其作为天然成分在口腔护理产品中的进一步开发。
**一、研究背景与问题提出**
Zanthoxylum limonella（泰语俗称Ma-kwaen）为芸香科（Rutaceae）芳香植物，广泛分布于东南亚，尤以泰国北部为多，其果实具特征性柑橘样香气，长期兼作食用香料与传统药材。近年来，因其宜人香气与多种生物活性，该植物精油（ZLO）作为食品、药品及个人护理产品的天然成分受到广泛关注。气相色谱–质谱联用（GC–MS）分析显示，ZLO主要由单萜烃类与含氧单萜类组成，以柠檬烯（limonene）为主，其次为桧烯（sabinene）、β-蒎烯（β-pinene）、α-水芹烯（α-phellandrene）与萜品烯-4-醇（terpinen-4-ol），但其相对丰度随植物部位、采收条件与提取方法而变化。此外，ZLO对包括多重耐药菌株在内的广谱革兰阳性与革兰阴性菌显示抗菌活性，且全精油常优于其单一主要成分；柠檬烯对变形链球菌（Streptococcus mutans）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）及念珠菌属（Candida spp.）等口腔病原体具抑制作用，ZLO的抗氧化能力亦经化学与细胞水平试验证实，提示其作为天然生物活性成分具有较高潜力。
精油在口腔护理配方中的主要局限在于理化稳定性差，贮藏期间易挥发、氧化与化学降解，尤其在热、光与氧暴露条件下更为明显，从而降低其化学品质与生物学功效。纳米包封因而成为改善精油水分散性、保护其免受环境降解并实现控释的有前景策略；已有研究表明微囊化与纳米乳体系可提高精油的稳定性与抗菌活性，纳米乳亦被研究作为口腔护理中精油的递送体系。然而，关于纳米包封对ZLO掺入漱口水与牙膏等口腔护理配方后理化稳定性与化学保留率的影响，现有信息有限。因此，本研究设定了两个主要目标：其一，通过筛选适宜的亲水亲油平衡值（HLB）与表面活性剂浓度，开发并优化含ZLO的水包油型（oil-in-water）纳米乳并表征其理化性质；其二，比较游离ZLO与纳米乳在掺入牙膏和漱口水配方前后的贮藏稳定性，在冷藏（4 °C）、常温、加速（45 °C）与连续光照条件下历时12周，通过监测外观、理化性质与化学保留率进行评价，并以ZLO主要挥发性成分柠檬烯为参照物测定表观柠檬烯当量保留率，作为贮藏期间化学保留率的初步指标。
**二、主要关键技术方法**
研究人员自泰国清莱府采集Z. limonella果实，凭证标本（No. CBIS-ZL-001）保存于泰国Mae Fah Luang大学化妆品科学学院化妆品与美容可持续发展创新中心（CBIS）参考收藏；果实分为新鲜与阴干（通风处常温18天）两组。关键技术包括：以200 L商用蒸馏装置水蒸气蒸馏提取精油并以GC–MS（HP-5MS柱，NIST库比对及保留指数核对）分析组成；采用低能乳化法制备纳米乳，先以HLB 10.0–15.0筛选、再以20%–26%优化表面活性剂浓度；以动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数（PDI）与Zeta电位；开展12周加速贮藏稳定性试验；以紫外–可见分光光度法（UV–Vis，252 nm）估算表观柠檬烯当量保留率；以琼脂孔扩散法、肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）与最低杀菌浓度（MBC），并以扫描电子显微镜（SEM）观察细菌形态。
**三、研究结果**
**2.1 ZLO的提取与化学组成** 新鲜果实具绿色完整果皮与紧密果簇，干燥后果皮呈深棕色并完全开裂露出黑色种子；新鲜果实精油几乎无色，干燥果实精油呈清澈淡黄色，提示干燥诱导的氧化敏感挥发性成分部分氧化。干燥果实精油得率（10.00%）高于新鲜果实（8.33%），可能与水分去除提高干物质中精油相对比例、改善分泌组织破坏与传质有关。GC–MS结果显示，计算保留指数与文献值吻合良好，两种精油均以单萜类为主。新鲜果实精油（ZLO-1）主要成分为柠檬烯（29.52%）、α-水芹烯（19.75%）、桧烯（11.33%）、α-蒎烯（5.50%）、顺式-β-罗勒烯（5.04%）、萜品烯-4-醇（4.44%）、β-月桂烯（3.54%）、对伞花烃（p-cymene，3.05%）、芳樟醇（2.88%）与乙酸香叶酯（geranyl acetate，2.86%）；干燥后柠檬烯仍为最主要成分并升至34.84%，萜品烯-4-醇显著升至15.75%，γ-萜品烯、α-萜品烯与萜品油烯（terpinolene）中度升高，而α-水芹烯显著降至7.10%，α-蒎烯（5.50%降至2.30%）、β-月桂烯（3.54%降至2.16%）、芳樟醇（2.88%降至1.78%）与乙酸香叶酯（2.86%降至0.91%）亦下降，桧烯、顺式-β-罗勒烯与对伞花烃变化较小。α-水芹烯的显著下降与挥发损失和/或干燥中的化学变化有关，与Pituranthos chloranthus及Zingiber officinale精油的既往报道一致；柠檬烯的相对升高更可能源于相对富集效应（挥发性更强成分优先损失）而非绝对浓度增加；萜品烯-4-醇约3.5倍的升高可能归因于干燥过程中的氧化与水解转化，与Melissa officinalis的类似报道相符。上述组成变化可能影响ZLO的感官与生物活性：新鲜果实精油富含与清新明亮柑橘样香气相关的α-水芹烯等单萜烃，干燥果实精油则富集常与温暖草本香韵相关的含氧单萜萜品烯-4-醇；单萜烃类抗菌活性通常较弱，而含氧单萜尤其是萜品烯-4-醇因极性较高而具有更强的抗菌、抗炎与抗氧化活性。综合有利化学组成（尤其较高萜品烯-4-醇含量）与干燥在延长原料货架期、支持非季节加工、提高批次一致性与简化粉碎及水蒸气蒸馏等方面的实用优势，干燥果实精油（ZLO-2）被选为制备NE-ZLO及后续掺入口腔护理配方的来源油。
**2.2 纳米乳的制备与表征**
**2.2.1 ZLO在载体油中的溶解度筛选** 载体油选择是纳米乳配方的关键步骤，直接影响精油的增溶、液滴形成、包封率与长期稳定性；溶解疏水生物活性成分能力更强的载体油可形成更稳定的纳米乳并减少贮藏中的相分离。基于既往报道柠檬烯在荷荷巴油（jojoba oil）中溶解度更高，且荷荷巴油主要由长链液态蜡酯构成，具增强的氧化稳定性与耐热性，其独特结构既保证与亲脂性萜类的强亲和力，又可保护柠檬烯等氧化敏感单萜免于降解；据此选择荷荷巴油用于后续配方与HLB优化。
**2.2.2 表面活性剂HLB对纳米乳性质的影响** 研究选用三种结构不同的非离子表面活性剂——PEG-40氢化蓖麻油（PEG-40 HCO）、Tween 80与Span 80——以调节体系总HLB并提供互补的界面功能：PEG-40 HCO凭借庞大聚氧乙烯头基与氢化蓖麻油疏水部分增强亲脂性化合物的增溶与精油载量，高亲水性的Tween 80有效降低界面张力并促进液滴形成，低HLB的亲脂性Span 80改善油水界面处的表面活性剂堆积，预期形成紧密而柔韧的界面膜。基于荷荷巴油所需HLB（rHLB）为10–11的报道，制备HLB 10.0–15.0的乳化剂混合体系。目视观察显示各配方均为无相分离的均匀半透明分散体，NE-ZLO-3至NE-ZLO-7（HLB = 12.0–14.5）更透明，NE-ZLO-1、NE-ZLO-2与NE-ZLO-8呈不透明，较高透明度提示形成更细小液滴。随HLB由NE-ZLO-1升至NE-ZLO-6，液滴粒径由62.57 ± 0.98 nm逐渐降至47.37 ± 0.49 nm（p < 0.05），提示高HLB表面活性剂体系更有效降低界面张力并促进乳化中的液滴破碎；HLB进一步升高则粒径扩大，NE-ZLO-7与NE-ZLO-8分别增至54.20 ± 0.17 nm与64.77 ± 0.25 nm，提示过高亲水性混合体系降低其稳定油水界面的能力。PDI范围为0.174 ± 0.00至0.322 ± 0.01，NE-ZLO-5与NE-ZLO-6最低（0.174–0.180），NE-ZLO-8最高（0.322 ± 0.01），提示HLB 14.0时表面活性剂分子在油水界面堆积更有效，粒径与PDI同时降低。Zeta电位范围为?22.10 ± 0.87至?36.03 ± 0.64 mV，其负电荷幅度总体随HLB升高而增大，NE-ZLO-7与NE-ZLO-8绝对值最高（?34.93与?36.03 mV），但其粒径与PDI显著大于NE-ZLO-6，说明仅凭Zeta电位不足以预测纳米乳性能，界面稳定平衡、表面活性剂吸附效率及其与精油相的相容性对粒径与整体稳定性影响更大。
**2.2.3 表面活性剂浓度对纳米乳性质的影响** NE-ZLO-6含20%表面活性剂，NE-ZLO-9至NE-ZLO-11分别为22%、24%与26%。粒径随表面活性剂浓度升高而下降且差异显著（p < 0.05），由NE-ZLO-6的47.37 ± 0.49 nm降至NE-ZLO-9的39.53 ± 0.15 nm与NE-ZLO-10的36.23 ± 0.32 nm，与既往报道趋势一致；较小粒径可归因于更多表面活性剂分子吸附于油水界面所提供的更大界面覆盖及匀质过程中对液滴聚并的阻止。由20%增至22%使粒径降低逾14%，更高浓度下粒径变化缓慢，提示界面表面活性剂浓度可能已达饱和。所有配方PDI（0.180 ± 0.02至0.225 ± 0.01）均低于0.3阈值，体系相对均一，NE-ZLO-6分布最窄，PDI随浓度略升但仍在可接受范围。Zeta电位范围为?29.70 ± 0.44至?32.50 ± 0.89 mV，浓度由20%增至26%对其影响甚微，仅NE-ZLO-10与NE-ZLO-11差异显著（p < 0.05）；由于所用表面活性剂均为非离子型，其稳定性主要归因于液滴周围水化表面活性剂层提供的空间稳定作用而非静电排斥。综合而言，22%表面活性剂浓度已提供足够界面覆盖，进一步增至24%与26%仅带来边际改善，且化妆品配方中通常偏好较低表面活性剂浓度以降低刺激风险，故选择以22%表面活性剂获得最小粒径（40.83 ± 0.06 nm）与可接受PDI（0.207 ± 0.01）的NE-ZLO-9用于后续稳定性研究。
**2.3 贮藏期间稳定性**
**2.3.1 物理稳定性** 贮藏期间，游离ZLO特征性淡黄色逐渐褪去，在高温与连续光照下尤为明显，早在第2周即可见褪色并于第12周几近无色，可能与未受保护ZLO的热氧化与光氧化降解导致天然发色团氧化有关；NE-ZLO-9则保持原有外观且无相分离，仅浊度轻微增加，仍均匀分散而无可见油析、乳析、沉降或沉淀，其浊度增加可能归因于界面结构变化，而无褪色表明包封体系有助于在受试条件下保持视觉稳定性。NE-ZLO-9初始pH为6.10 ± 0.01，12周后在4 °C、常温、45 °C与连续光照下分别降至5.96 ± 0.02、5.92 ± 0.01、5.60 ± 0.01与5.81 ± 0.02，4 °C变化最小（ΔpH = ?0.14），45 °C降幅最大（ΔpH = ?0.50），提示高温对pH稳定性影响最大，pH下降可能反映精油或配方中其他成分的化学变化。NE-ZLO-9初始粒径、PDI与Zeta电位分别为40.83 nm、0.211与?31.10 mV。4 °C下物理稳定性最佳，粒径（40.83–37.50 nm）相对恒定、PDI略降（0.211–0.186）、Zeta电位变化可忽略（?31.10至?30.67 mV），其中粒径显著下降（p < 0.05）而Zeta电位不变（p > 0.05）。常温实验室光照下粒径于第4周后显著增大并于第12周达79.27 nm（p < 0.05），Zeta电位无显著变化，提示液滴逐渐生长。45 °C下粒径（32.17 nm）与PDI（0.105）反而更小，提示液滴群更均一，但长时间贮藏使Zeta电位绝对值显著降至?23.77 mV（p < 0.05），提示热暴露下界面稳定性逐渐下降。连续光照下粒径与PDI增幅最大，分别显著增至99.13 nm与0.343（p < 0.05），Zeta电位仅略变至?29.63 mV（p > 0.05）；与常温自然光及45 °C暗置相比，连续光照对纳米乳稳定性的影响大于单纯热作用，第12周时光照下粒径显著大于其他条件（p < 0.05），而45 °C仅引起液滴尺寸轻微变化，表明单纯热胁迫下界面膜基本完整。低温贮藏通过降低分子迁移率与提高连续相黏度限制液滴碰撞、聚并与氧化，从而最有效保持理化特性；类似温度依赖性行为亦见于含Lavandula dentata或Myristica fragrans精油的纳米乳。既往报道提示长时间光照可改变精油纳米乳的界面性质、促进液滴聚集与浊度变化，如柑橘精油纳米乳在光、热与氧暴露下液滴界面特性改变可促进聚并与Ostwald熟化等失稳过程，与本研究连续光照下粒径与PDI增幅显著更大的结果一致。45 °C下粒径与PDI逐渐下降而化学降解更大，可能与高温下连续相低黏度与分子迁移率增加促进液滴重排有关。Zeta电位仅在45 °C下显著下降，反映液滴间静电排斥逐渐丧失；粒径与Zeta电位变化并不总是一致，说明仅凭粒径无法完全预测长期胶体稳定性，需结合外观、粒径、PDI与Zeta电位等多种互补参数评价。
**2.3.2 不同配方中ZLO的化学稳定性** 贮藏期间游离ZLO逐渐失去特征淡黄色，在45 °C与连续光照下第4周内即明显褪色并持续至第12周，黄色消退与柠檬烯当量保留率显著下降相伴，归因于挥发与随后的氧化降解导致的挥发性成分持续损失。化学稳定性测试显示，游离ZLO在冷藏与常温贮藏12周后仅保留49.71%与46.30%的柠檬烯，而45 °C与连续光照下分别骤降至21.98%与28.99%；需强调本文表观柠檬烯当量保留率基于252 nm吸光度，属配方的经验性光学稳定性指标，而非完整柠檬烯的确定性定量或其降解动力学。上述结果表明热与光通过挥发、自氧化与光氧化的共同作用显著加速挥发性萜类的降解。相比之下，NE-ZLO-9在所有贮藏条件下的表观柠檬烯当量保留率均显著高于游离ZLO（p < 0.05），12周后冷藏与常温下分别高达87.65%与85.06%，45 °C与连续光照下仍分别保留58.84%与78.94%；与游离ZLO相比，纳米包封在冷藏与常温下使保留率提高约1.8倍，在加速与连续光照下提高约2.7倍，显示出在环境胁迫下的强保护作用，其增强稳定性可归因于精油被包封于表面活性剂稳定的纳米级液滴中，界面表面活性剂层可减少被包封油与环境因素的直接接触并限制挥发性成分损失。总体而言，NE-ZLO-9的稳定性取决于贮藏条件与所评价的理化参数：冷藏（4 °C）最能保持理化性质与外观，连续光照主要促进胶体失稳，高温对化学保留率的影响大于对物理稳定性的影响。进一步评价游离ZLO与NE-ZLO-9掺入牙膏与漱口水基质后的稳定性：所制牙膏为均匀光滑的米色乳膏、无可见相分离，漱口水为澄清透明黄色溶液、无可见沉淀；TP-ZLO与TP-NE-ZLO-9初始黏度分别为35.91 ± 0.01与34.84 ± 0.01 Pa s，而MW-ZLO与MW-NE-ZLO-9因黏度低于所用旋转黏度计配置（S21转子，1 rpm）的可测范围而无法准确测定，宜采用毛细管黏度计。贮藏条件影响牙膏黏度，研究末期仅45 °C贮藏的牙膏黏度大幅升高，可能源于牙膏基质变化。TP-ZLO与TP-NE-ZLO-9初始pH分别为6.90与6.65，MW-ZLO与MW-NE-ZLO-9分别为6.85与6.79，12周内均逐渐变化但始终高于5.5（低于该值常与釉质脱矿风险增加相关），最大变化通常见于较高温度与连续光照，漱口水降幅更大。牙膏内在稳定性最强，所有贮藏条件下柠檬烯当量保留率均超过60%，第12周TP-ZLO为62.92%–71.59%、TP-NE-ZLO-9为69.24%–77.62%，二者差异相对较小；两种牙膏稳定性提高可能与半固体基质黏度提供保护性环境有关，乳液氧化的扩散–反应模型提示提高黏度可降低分子迁移率与氧在水相域中的传输，乳化剂层亦可为氧向油相传输提供额外传质屏障，但本研究未直接测定氧扩散，上述机制应视为可能的影响因素而非稳定性改善的直接证据；两者保留率差异较小说明牙膏基质本身对稳定ZLO起重要作用并可能限制纳米包封的额外效益。漱口水配方则从纳米包封中获益更大，作为与黏稠半固体牙膏理化环境不同的自由流动水性配方，MW-NE-ZLO-9在整个贮藏期间保留率持续高于MW-ZLO，研究末期分别为67.72%–77.44%与62.82%–71.78%，最大差异见于加速温度与连续光照下，提示纳米乳化在漱口水中提供的额外保护作用较牙膏中更明显。总体而言，纳米包封与配方基质似乎提供互补的稳定作用：纳米包封提高ZLO成分的保留率，配方基质在贮藏中提供额外保护；在所研究配方中，牙膏提供最大的内在保护，而纳米包封的额外效益在漱口水中更明显。
**2.4 抗菌活性** 研究以琼脂孔扩散法与肉汤微量稀释法评价ZLO与NE-ZLO-9对S. mutans的抗菌活性，并以扫描电子显微镜（SEM）观察处理诱导的形态变化。无抑菌圈并不总意味着缺乏抗菌活性，因琼脂扩散取决于抗菌成分的释放与在琼脂中的分布，将ZLO掺入纳米乳可能降低试验中挥发性成分的即时可利用性。肉汤微量稀释结果证实NE-ZLO-9保留抗菌活性，其最低抑菌浓度（MIC）为3.125%，但在受试浓度范围内未达到最低杀菌浓度（MBC，>50%）；游离ZLO的MIC较低（0.078%），MBC为0.3125%。NE-ZLO-9表观活性较低可能与其基质中化合物的初始可利用性下降有关。在成品原型中，NE-ZLO-9以1.0%（w/w）使用，相当于约0.10%（w/w）ZLO，低于NE-ZLO-9的MIC（3.125%），故不应推定成品牙膏或漱口水具有该纳米乳的抗菌活性（成品未直接测试）；尽管游离ZLO水平（0.10% w/w）接近原料ZLO的MIC（0.078% v/v），但浓度单位与配方基质不同限制了直接比较。SEM显示：未处理细胞形态相对均一、表面光滑；DMSO处理细胞形态大体相似但可见部分表面不规则；NE-ZLO-9处理细胞出现部分表面不规则与形态改变，但多数细胞仍保持原有形态；ZLO处理细胞则出现细胞壁表面不均、凹陷与变形等显著形态改变，与ZLO在所测条件下抗菌活性强于NE-ZLO-9的抗菌结果一致。
**四、讨论与结论**
研究讨论围绕干燥引起的组成改变及其对香气与活性的意义、荷荷巴油载体与混合非离子表面活性剂体系在界面稳定中的作用、HLB与表面活性剂浓度的优化权衡，以及贮藏稳定性中物理与化学指标的不一致性展开，指出纳米包封与配方基质提供互补的稳定效应，牙膏的高黏度基质本身即为ZLO提供显著保护并可能限制纳米包封的附加效益，而漱口水作为低黏度水性体系从纳米包封中获益更明显；同时强调表观柠檬烯当量保留率系基于吸光度的经验性指标，且成品中ZLO浓度低于NE-ZLO-9的MIC，不宜推定成品抗菌活性。研究结论为：本研究显示遮光干燥与纳米乳配方的结合是提高Z. limonella精油（ZLO）用于口腔护理适用性的有效策略。遮光干燥提高了精油得率并通过增加柠檬烯与萜品烯-4-醇的相对丰度改变了其化学谱。优化后的纳米乳具有较小液滴粒径与良好物理稳定性，在贮藏期间对挥发性成分提供更好保护。纳米包封显著改善了表观柠檬烯当量保留率，尤其在加速与连续光照暴露条件下。掺入牙膏与漱口水进一步增强了ZLO的稳定性，但保护程度取决于配方基质：牙膏提供更大的内在保护，可能与其高黏度基质有关，而漱口水从纳米包封中获益更为显著。总体而言，上述结果表明纳米乳化是改善Z. limonella精油贮藏稳定性的有前景途径，并支持其作为稳定天然成分在口腔护理产品中的潜在应用。尽管原型配方仅含0.22%（w/w）非离子表面活性剂，但这并不能证实口腔黏膜安全性，尤其因萜类可能增强膜通透性，因此在进一步用于口腔保健之前，仍需采用TR146或HGF-1等口腔细胞模型开展体外细胞毒性与膜完整性试验。
