《Molecules》：Discovery of Two Potential and Novel Toll-like Receptor 7 Antagonists via Molecular Docking, Molecular Dynamics Simulation and In Vitro Biological Evaluation
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目的：Toll样受体7（TLR7）是一种重要的模式识别受体，主要参与单链RNA的识别，并与多种疾病进程密切相关。在人类中，TLR7拮抗剂在减轻炎症和缓解自身免疫损伤方面的巨大潜力已被证实。在家畜和家禽中也观察到类似效果。因此，本研究以猪TLR7为靶点，将虚拟筛
目的：Toll样受体7（TLR7）是一种重要的模式识别受体，主要参与单链RNA的识别，并与多种疾病进程密切相关。在人类中，TLR7拮抗剂在减轻炎症和缓解自身免疫损伤方面的巨大潜力已被证实。在家畜和家禽中也观察到类似效果。因此，本研究以猪TLR7为靶点，将虚拟筛选与异源报告基因检测相结合，以鉴定潜在配体，旨在为免疫调节剂的开发提供研究基础。方法：通过同源建模预测猪TLR7的结构，并进行分子对接以对潜在配体进行虚拟筛选。预测了小分子的ADMET和毒性特性。随后，采用小鼠TLR7报告细胞进行TLR7活性和细胞毒性的体外检测。进一步分析了命中化合物与受体之间的相互作用模式和分子动力学模拟。结果：通过同源建模预测了猪TLR7结构。根据分子对接评分排名以及ADMET和毒性预测，筛选出50种具有满意药代动力学特性和安全性的化合物，并验证了它们对R848诱导的TLR7激活的抑制效果。其中，两种具有新颖结构的命中化合物HY02-35和HY02-46表现出显著的小鼠TLR7拮抗活性。HY02-35的母核结构为2-吲哚酮，其抑制浓度范围为10.25至38.23 μM，中位估计值为14.73 μM。HY02-46的核心结构为1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑，其IC50介于21.92至36.00 μM之间，中位估计值为26.61 μM。上述命中化合物与猪TLR7具有较强的相互作用，与受体形成稳定的复合物，并能显著降低IFN-β和TNF-α的mRNA水平。结论：简而言之，本研究获得了两种具有新颖结构和中等体外抑制活性的命中化合物。这些命中化合物为后续在猪体内的结构优化和药理学研究提供了起点。
论文解读文章
研究背景与意义
Toll样受体7（TLR7）作为一种位于内涵体膜上的模式识别受体（PRR），在识别病原体相关分子模式（PAMP）如单链RNA（ssRNA）中发挥关键作用，连接着先天免疫和适应性免疫应答。TLR7的异常激活与多种炎症性和自身免疫性疾病密切相关，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。因此，TLR7拮抗剂能够通过阻止TLR7激活，减少促炎细胞因子的分泌，从而缓解相关疾病的症状。此外，TLR7配体在畜禽性别控制方面也展现出巨大潜力，对畜牧业具有重要价值。然而，目前针对畜禽疾病防治领域的TLR7拮抗剂研究尚不充分，不同物种对TLR7配体的反应也存在差异。特别是，猪TLR7的晶体结构尚未被解析，这限制了针对猪的特定TLR7拮抗剂的开发。因此，本研究以猪TLR7为靶点，旨在通过基于结构的虚拟筛选方法，结合体外实验，发现潜在的猪TLR7拮抗剂，为畜禽免疫调节剂的研发提供新的起点和参考依据。
研究方法概述
研究人员首先利用同源建模技术，以猴TLR7（PDB ID: 5GMF）为模板，预测了猪TLR7的三维结构，并通过拉氏图、ProSA等多种方法评估了模型的可靠性。随后，采用Schr?dinger套件中的Glide模块，对包含约20万个化合物的Specs HTS化合物库进行了分级虚拟筛选（HTVS、SP、XP模式）。筛选出的化合物进一步通过ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）预测和药物相似性规则（Lipinski五规则、Veber规则）进行评估，最终选出50种化合物用于后续实验验证。体外生物学评价使用了小鼠TLR7报告细胞系和THP-1巨噬细胞，通过荧光素酶报告基因实验和CCK-8法分别检测化合物的TLR7拮抗活性和细胞毒性。对于两个命中化合物，研究人员还进行了100 ns的分子动力学（MD）模拟和MM-PBSA结合自由能计算，以深入分析其与受体的动态相互作用和结合稳定性。
研究结果
2.1. 模板鉴定与序列相似性
通过BLAST比对，选择猴TLR7（PDB ID: 5GMF）作为同源建模模板，其与猪TLR7的序列一致性为76.0%，序列相似性为85.9%。
2.2. 同源建模与模型可靠性评估
构建的猪TLR7模型GMQE评分为0.59，QMEAN评分为-2.49。拉氏图显示78.8%的氨基酸残基位于最允许区，Verify得分为699.6，接近预期高分值，ProSA分析的Z-score也在合理范围内。结果表明该模型质量可靠，可用于后续研究。
2.3. 分子对接
采用Glide的HTVS、SP和XP模式进行逐步虚拟筛选，根据对接评分排名筛选出前200个潜在配体。
2.4. ADMET分析与药物相似性预测
对200个候选化合物进行ADMET和毒性预测，综合考虑对接分数、药代性质、安全性和可获得性后，最终购买了50个化合物进行后续验证。
2.5. HY02-35和HY02-46展现潜在TLR7抑制活性
利用小鼠TLR7报告细胞进行验证，发现HY02-35和HY02-46能显著抑制R848诱导的TLR7激活。HY02-35的IC50中位估计值为14.73 μM，HY02-46为26.61 μM。两者在高浓度下均表现出一定程度的细胞毒性。这两种化合物具有新颖的母核结构（分别为2-吲哚酮和1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑）。
2.6. 相互作用分析
分子对接结果显示，HY02-35和HY02-46通过与猪TLR7的关键氨基酸残基（如TYR351、GLN354、VAL355*、THR587等）形成氢键、静电相互作用和疏水相互作用，稳定地结合在受体口袋中。
2.7. MD模拟与MM-PBSA计算
100 ns MD模拟表明，两个化合物与猪TLR7形成的复合物在模拟后期趋于稳定，RMSD、Rg和SASA等参数波动较小。吉布斯能量图谱显示复合物形成了单一的最小能量簇。MM-PBSA计算得到HY02-35和HY02-46的平均结合自由能分别为-20.32 ± 3.54 kcal/mol和-17.13 ± 4.08 kcal/mol，表明两者与受体有较强的自发结合亲和力。
2.8. 对细胞因子基因表达的调控作用
在THP-1巨噬细胞中，HY02-35和HY02-46均能在一定程度上降低由R848刺激引起的IFN-β和TNF-α的mRNA表达水平，显示出缓解TLR7介导的炎症反应的潜力。
讨论与结论
讨论部分总结： 研究人员指出，本研究成功运用同源建模、虚拟筛选和体外实验相结合的策略，发现了两种结构新颖的TLR7拮抗剂，为TLR7配体开发提供了新骨架。然而，研究也存在局限性，包括：筛选规模相对有限，仅对50个化合物进行了活性验证；由于条件限制，未使用原代外周血单个核细胞（PBMC）进行验证，也未在猪源细胞或体内进行功能验证；命中化合物的活性中等且伴有细胞毒性，选择性也尚未探索。未来工作将致力于开发活性更强、毒性更低的配体，并在猪等家畜中进行体内药效和安全性评价。
研究结论部分翻译： 在本研究中，研究人员鉴定了两种具有潜在TLR7抑制活性和新颖母核结构的命中化合物。两种小分子HY02-35和HY02-46对小鼠TLR7表现出显著的抑制活性，但也表现出一定程度的细胞毒性。它们均能与猪TLR7的关键氨基酸残基形成氢键、静电相互作用、范德华力和疏水相互作用。MD模拟结果显示，在100 ns的模拟期间，两种化合物与猪TLR7形成的复合物未发生显著构象变化，系统趋于平衡和稳定。根据MM-PBSA的结果，HY02-35和HY02-46与猪TLR7的平均结合自由能分别为-20.32 ± 3.54和-17.13 ± 4.08 kcal/mol，表明它们与猪TLR7具有高结合亲和力，并能自发结合。此外，这两种命中化合物能显著抑制THP-1细胞中R848诱导的细胞因子转录水平上调。当前的研究不仅为候选TLR7拮抗剂的研究提供了一个起点，也为后续的结构优化和活性评价提供了重要参考。值得注意的是，HY02-35和HY02-46的细胞活性是在小鼠和人细胞系中评估的，其对猪TLR7的抑制潜力有待进一步验证。这两个命中化合物目前可被视为具有深入研究价值的分子，但仍需进一步研究来确定它们在猪细胞或体内的有效性、选择性、安全性和药代动力学特征。
