《Microorganisms》：Anti-MRSA Activity and LC-HRMS Chemical Profiling of a Bioactive Fraction from the Endolichenic Fungus Pestalotiopsis lushanensis: Exploratory Network Analysis and Molecular Docking
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是重要的耐药病原菌，凸显了从可培养微生物资源中挖掘抗菌活性物质的必要性。本研究从地衣Hypogymnia flavida中分离到一株内生
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是重要的耐药病原菌，凸显了从可培养微生物资源中挖掘抗菌活性物质的必要性。本研究从地衣Hypogymnia flavida中分离到一株内生真菌HF-080，经鉴定为Pestalotiopsis lushanensis。研究人员通过大米固态发酵、活性导向分离、抗菌活性测定、LC-HR-ESI-MS化学谱分析、蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction，PPI）网络分析及分子对接，评估了其抗MRSA活性、化学特征及候选蛋白。组分11-25-1表现出初步抗MRSA活性，在TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）法检测下抑制终点为1 mg/mL，在4 mg/mL条件下传代培养未检出菌落。LC-HR-ESI-MS分析初步注释了83个化学特征；然而，由于缺乏适宜的培养基空白和分析空白，并非所有检测信号均可明确归因于真菌代谢。网络分析优先筛选出FtsZ、RpoB、RecA和MetG，并将耐药相关蛋白PBP2a作为额外的分子对接靶标。在所评估的推定注释候选中，Roridin A在多个蛋白模型中表现出较优的计算排名。综上，组分11-25-1在体外表现出抗MRSA活性，为后续活性组分的分离与结构确证以及候选靶标的实验验证奠定了基础。
论文解读：内生真菌庐山拟盘多毛孢活性组分抗MRSA作用及化学表征研究
一、研究背景与意义
抗菌药物耐药已成为全球重大公共卫生挑战。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是临床重要的耐药病原菌，可引起皮肤软组织感染、血流感染及医疗器械相关感染等多种严重疾病。MRSA治疗面临的核心难题在于其获得mecA基因，该基因编码低亲和力青霉素结合蛋白PBP2a，赋予其对多种β-内酰胺类抗生素的耐药性。此外，MRSA还可对大环内酯类、四环素类及氟喹诺酮类等抗生素表现出敏感性降低或耐药，进一步限制了治疗选择。因此，亟需发现具有新颖化学结构和潜在作用机制的抗菌候选分子。天然产物作为抗菌候选来源受到广泛关注。地衣是由地衣型真菌与一种或多种光合伙伴形成的共生体系，可产生结构多样的次级代谢产物。然而，天然地衣生长缓慢且生态脆弱，大规模采集野生地衣的可持续性受限。地衣内生真菌提供了可再生且可培养的微生物资源，相较于地衣体，其生长更快、更易培养，更适合基于发酵的代谢产物生产。已有研究表明地衣内生真菌可产生生物碱、萜类、聚酮类、脂肪酸、酚类及甾体等多种代谢物，部分具有抗菌或抗生物膜活性。因此，地衣内生真菌是抗MRSA先导化合物发现的重要可再生资源，但其活性成分及抗菌机制往往有待深入阐明。基于此，本研究旨在考察可培养地衣内生真菌Pestalotiopsis lushanensis HF-080的抗MRSA潜力，通过比较不同发酵-提取体系、活性导向分离获得活性组分、评价其对MRSA ATCC 43300的抗菌活性，并结合LC-HR-ESI-MS化学表征、PPI网络分析及分子对接，为后续活性成分鉴定和靶标验证奠定基础。
二、主要关键技术方法
研究人员采用了以下主要关键技术方法：从大理苍山采集地衣Hypogymnia flavida样品，经形态学观察、化学显色反应和薄层色谱（TLC）鉴定后，采用紫外表面灭菌和组织块法分离地衣内生真菌；通过形态学特征及ITS、tef1-α、tub2多基因位点序列分析构建最大似然系统发育树，将菌株HF-080鉴定为P. lushanensis；比较五种发酵-提取体系后选择大米固态发酵进行放大培养；采用硅胶柱色谱和制备薄层色谱进行活性导向分离；通过微量肉汤稀释法、TTC染色、平板计数法及时间-杀菌曲线评价抗菌活性；利用LC-HR-ESI-MS对活性组分进行非靶向化学谱分析；基于文献筛选99个MRSA相关候选基因，通过DAVID平台进行GO和KEGG富集分析，利用STRING 12.0构建PPI网络并结合CytoHubba八种算法鉴定枢纽蛋白；采用MOE软件对13个推定注释化合物与FtsZ、RpoB、RecA、MetG及PBP2a五个蛋白进行分子对接。
三、研究结果
3.1 H. flavida的鉴定及地衣内生真菌的分离
研究人员基于外部形态特征、化学显色反应和TLC分析，将采集的地衣标本鉴定为H. flavida。经紫外表面灭菌后，对照平板均未见菌落生长，表明表面微生物已被有效去除。采用组织块法从136个组织块中获得94株可培养地衣内生真菌。
3.2 HF-080的形态学及多基因系统发育鉴定
菌株HF-080在PDA上形成致密绒毛状乳白色菌落，菌丝具隔膜，分生孢子呈纺锤形，具四个隔膜分为五个细胞。ITS序列BLAST分析显示与P. lushanensis 100%同源，基于ITS、tef1-α和tub2的单基因及联合系统发育分析均支持HF-080归属于P. lushanensis进化枝。
3.3 基于发酵-提取体系比较的大米固态发酵选择
五种发酵体系中，PDA培养粗提物抑菌圈最大（27.0±0.5 mm），大米固态发酵和PDB发酵粗提物抑菌圈均大于20 mm，MEB发酵活性较弱，SDB发酵未见抑菌活性。综合考虑活性、粗提物回收率、成本及放大可行性，选择大米固态发酵进行放大培养。
3.4 活性导向分离获得组分11-25-1
通过硅胶柱色谱和制备薄层色谱逐步分离，最终获得150 mg活性组分11-25-1，该组分在紫外下仍显示约8-9个斑点，表明其为部分纯化的混合物。
3.5 组分11-25-1对MRSA ATCC 43300的体外抗菌活性
TTC法检测显示组分11-25-1在1 mg/mL浓度下抑制MRSA生长，4 mg/mL传代培养未检出菌落。万古霉素阳性对照MIC为1 μg/mL，验证了实验体系的可靠性。时间-杀菌曲线显示，0.5×MIC处理未能阻止细菌增殖，1×MIC仅产生短暂抑制后出现再生长，2×MIC可维持或轻微降低活菌数但未达到杀菌阈值，而MBC浓度（4 mg/mL）在24 h内使活菌数降低≥3 log10 CFU/mL，表现出浓度依赖性抗菌活性。
3.6 LC-HR-ESI-MS化学谱分析及推定注释
LC-HR-ESI-MS分析对组分11-25-1中的83个化学特征进行了推定注释，涵盖生物碱及咪唑衍生物、萜类、酚类、酯/脂肪酸及其他小分子五类。部分推定注释化合物具有文献报道的抗菌、抗真菌、抗炎、抗氧化或抗肿瘤活性。但需注意，由于未设置未接种培养基空白和程序空白对照，部分信号可能来源于培养基底物、溶剂或背景污染，所有注释均为推定性质。
3.7 MRSA相关基因的GO和KEGG富集分析
对99个文献筛选的MRSA相关候选基因进行富集分析，结果显示这些基因显著富集于细胞壁组装、肽聚糖生物合成、细胞分裂等生物学过程，以及ATP结合、rRNA结合和核糖体结构组成等分子功能，KEGG通路主要涉及核糖体功能和肽聚糖生物合成。
3.8 MRSA相关蛋白的PPI网络分析
STRING分析构建了包含82个节点和241条边的PPI网络，平均节点度为5.88。FtsZ和RpoB表现出较高的连接度和中心性，被优先作为网络枢纽蛋白。
3.9 枢纽蛋白优先排序及对接蛋白选择
CytoHubba八种算法一致识别出FtsZ、RpoB、RecA和MetG四个主要枢纽蛋白。这些蛋白分别参与细菌细胞分裂、转录、DNA修复和蛋白质翻译等重要生物学过程。PBP2a因其在MRSA β-内酰胺耐药表型中的确定作用被额外纳入对接靶标。
3.10 分子对接虚拟评价
13个推定注释化合物与五个蛋白的分子对接结果显示，Roridin A在FtsZ（S = ?7.48 kcal/mol）、RecA、MetG（S = ?7.40 kcal/mol）和PBP2a（S = ?7.35 kcal/mol）中均获得最低对接分数，在RpoB中排名第二。8,9-epoxy-3,10-diisobutyryloxythymol和Robustone methyl ether也在多个靶标中表现出较优的对接排名。
四、讨论与结论
讨论部分指出，菌株HF-080的物种鉴定通过形态学和多基因系统发育分析得到可靠支持。大米固态发酵的选择主要基于粗提物回收率、成本和放大可行性的实际考量。组分11-25-1的MIC为1 mg/mL、MBC为4 mg/mL，属于部分纯化组分的中等活性水平，直接与纯化合物比较需谨慎。时间-杀菌动力学表明其杀菌作用需要显著高于MIC的浓度。LC-HR-ESI-MS分析揭示了活性组分的化学复杂性，但缺乏空白对照限制了信号归属的确定性，部分注释可能对应外源或工业化合物。PPI网络和分子对接分析作为探索性优先排序工具，为后续研究提供了候选蛋白和候选化合物，但网络中心性并不等同于靶标有效性，对接分数也不代表实验结合亲和力。Roridin A虽在多个蛋白模型中排名靠前，但其哺乳动物细胞毒性和对人淋巴细胞活化的抑制作用提示需谨慎解读其作为抗菌开发候选的潜力。
结论部分翻译：对地衣内生真菌Pestalotiopsis lushanensis HF-080大米发酵提取物进行活性导向分离，获得组分11-25-1，该组分在测试条件下对MRSA ATCC 43300表现出初步体外抗菌活性，TTC法检测抑制终点为1 mg/mL，4 mg/mL传代培养未检出菌落。MIC和MBC仍需在标准化接种条件下进一步验证。LC-HR-ESI-MS分析对83个化学特征进行了推定注释，但由于缺乏适宜的培养基和分析空白，所有检测信号尚不能明确归因于真菌代谢。探索性网络分析和分子对接优先排序了候选蛋白和推定注释化合物（包括Roridin A）以供后续研究。所观察到的抗菌活性归属于整个组分，单个注释化合物的活性及直接靶标结合均未得到证实。化合物的分离与结构确证、含适当空白对照的化学谱分析、纯化化合物的抗菌评价、临床MRSA分离株的扩展测试以及实验靶标验证，是阐明活性成分及其作用机制所必需的。上述发现支持进一步研究可培养地衣内生真菌作为抗菌代谢产物的潜在来源。
