芒果细菌性角斑病抗性特异性KASP标记的开发与初步验证

《Plants》：Development and Preliminary Verification of Specific KASP Markers for Mango Resistance to Bacterial Angular Leaf Spot

　　

细菌性角斑病（bacterial angular leaf spot）由柑橘黄单胞杆菌芒果致病变种（Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae，Xcm）引起，是制约芒果生产的重要病害。抗性相关分子标记可提高抗性种质筛选效率并加速芒果育种进程，然而针对细菌性角斑病的此类标记仍十分有限。本研究重新分析了高抗品种‘热农1号’（‘Renong No. 1’）与高感品种‘凯特’（‘Keitt’）的转录组及全基因组重测序数据，以鉴定候选抗性基因中的非同义单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）。在转化为竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP）检测的86个候选SNP中，有37个在25份已知抗性表型的芒果种质中产生了清晰稳定的基因型聚类。SNP26与这些种质的抗性表型表现出高度一致性，随后被用于对322份芒果种质资源进行基因分型，这些种质被分为两个基因型组，分别包含34份和288份种质。基于SNP26基因分型结果，研究人员选取72份种质进行室内果实针刺接种，并根据病斑发展情况将其划分为5个抗性等级。SNP26位于15号染色体1,299,510位点，处于HSP83A基因编码区内。‘凯特’在该位点为G，‘热农1号’为A，导致亮氨酸到缬氨酸的替换。Sanger测序证实了该位点的多态性。在Xcm接种后，HSP83A在两个品种中表现出相反的表达模式。保守结构域和系统发育分析表明，HSP83A属于HSP90/HtpG家族，与其他植物中的同源蛋白关系密切。上述发现表明，SNP26是一个有应用前景的抗性相关标记，可用于芒果细菌性角斑病抗性种质的初步鉴定，并可能有助于芒果育种中的分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）。

芒果细菌性角斑病抗性KASP标记研究：从SNP筛选到种质鉴定的系统解析

一、研究背景与意义

芒果（Mangifera indica L.）是全球重要的热带亚热带水果，在我国海南、广西、云南、广东和四川等地广泛种植。近年来，由柑橘黄单胞杆菌芒果致病变种（Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae，Xcm）引起的细菌性角斑病（bacterial angular leaf spot）在我国多个芒果产区频繁发生，严重威胁芒果生产。该病害可侵染芒果叶片、枝条和果实，叶片受害后出现具黄色晕圈的黑色病斑，严重时落叶；果实受害后形成黑褐色溃疡，严重影响果实外观、品质和产量。目前该病害主要依靠栽培管理和化学药剂防治，但存在劳动强度大、防效不稳定和环境污染等问题，因此培育抗病品种是实现病害持续防控的重要途径。

然而，芒果是多年生木本果树，基因组杂合度高，许多重要性状受多个微效基因调控，增加了抗性相关基因和位点挖掘的难度。同时，病害表型可能受材料发育阶段、接种条件和环境因素影响，仅依靠表型鉴定难以实现抗性材料的快速稳定筛选。现有研究对芒果细菌性角斑病抗性相关基因和分子标记的报道相对有限，而分子标记可直接检测个体间DNA序列差异，具有丰富性、分布广、稳定性高、受环境影响小等特点，已被广泛应用于种质资源鉴定、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等领域。因此，将抗性表型与基因组和转录组数据相结合，开发与芒果细菌性角斑病抗性相关的分子标记，对于提高抗性种质筛选效率和加速抗病育种进程具有重要意义。

二、主要技术方法

研究人员以高抗品种‘热农1号’和高感品种‘凯特’为主要材料，综合运用了以下关键技术方法：一是基于转录组和全基因组重测序数据的联合分析，筛选两品种间纯合但基因型不同、测序深度大于10×的外显子区非同义SNP位点；二是采用竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP）技术将候选SNP转化为分子标记，并利用25份已知抗性表型的芒果种质（来源于云南省华坪县和中国热带农业科学院南亚热带作物研究所芒果种质资源圃）进行初步筛选；三是利用322份芒果种质资源进行扩大群体基因分型；四是通过Sanger测序验证关键位点真实性；五是采用室内果实针刺接种法对72份种质进行抗性表型鉴定，按病斑直径划分为5个抗性等级；六是利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析HSP83A基因在Xcm接种后的表达变化；七是通过NCBI保守结构域搜索和系统发育分析解析HSP83A蛋白的结构与进化关系。

三、研究结果

2.1 抗性相关候选基因与SNP筛选

研究人员对‘热农1号’和‘凯特’的10个转录组分析组（T1–T10）进行SNP位点统计，每组检测到约843,282个SNP位点，其中转换位点751,006个、颠换位点462,106个。结合前期全基因组重测序数据、基因功能注释和转录组表达差异，共筛选出20个可能与芒果细菌性角斑病抗性相关的候选基因，功能注释涉及植物-病原互作、植物激素信号转导、MAPK信号通路、转录调控和防御相关蛋白编码。进一步筛选两品种均纯合但基因型不同、测序深度大于10且位于外显子区可能引起氨基酸改变的非同义突变位点，最终获得86个候选SNP用于后续KASP标记开发。

2.2 候选SNP的KASP标记开发与初步筛选

基于86个候选SNP及其侧翼序列设计KASP引物，利用25份已知抗性表型的芒果材料进行初步验证。结果显示，37个KASP标记产生清晰稳定的荧光信号，测试材料被分为明显的基因型聚类，表明这些标记具有良好的基因分型性能。结合25份材料的抗性鉴定结果，SNP26可将材料分为两个基因型组：一个基因型组包含1份高抗和1份中抗材料，另一组包含10份中感、9份感病和4份高感材料，基因型分组与已发表的抗性等级分组一致。随后利用SNP26对322份芒果种质进行KASP基因分型，材料被清晰分为两个基因型组，分别包含34份和288份材料，标记在扩大群体中表现出清晰稳定的分型效果。Sanger测序验证结果显示，‘凯特’在SNP26位点为G，‘热农1号’为A，与全基因组重测序结果一致，证实了该位点基因型差异的可靠性。

2.3 72份芒果种质细菌性角斑病抗性表型鉴定

研究人员从两个SNP26基因型组中选取72份芒果种质进行室内果实针刺接种，根据接种后第9天的病斑直径，3份种质被鉴定为高抗（1级），7份为中抗（2级），41份为中感（3级），16份为感病（4级），5份为高感（5级）。具有A/A基因型的10份种质全部为高抗或中抗材料，而具有G/G基因型的62份种质均为中感、感病或高感材料。将1–2级归为抗性、3–5级归为感病后，SNP26基因型与抗性表型显著关联（双侧Fisher精确检验，p < 0.001）。不同抗性等级材料的病斑扩展程度存在显著差异，高抗材料病斑扩展缓慢、直径小，高感材料病斑扩展最严重，出现明显突起，与田间典型症状相似。

2.4 HSP83A基因对细菌性角斑病侵染的表达响应

以高抗品种‘热农1号’和高感品种‘凯特’为材料，通过实时荧光定量PCR检测Xcm接种后不同时间点的基因相对表达量。结果显示，两个品种中HSP83A的相对表达量均呈先升后降趋势，在接种后2天达到最高值，6天时下降。以各品种0天样品为基准，‘热农1号’在2天和6天的相对表达倍数均高于‘凯特’。在6天时，‘热农1号’的相对表达水平仍高于基线水平，而‘凯特’已接近基线水平。这表明HSP83A在两个品种中表现出不同的表达变化模式，该基因可能参与芒果对细菌性角斑病病原菌接种的响应。

2.5 HSP83A蛋白保守结构域特征与系统发育关系

通过NCBI保守结构域搜索分析，芒果HSP83A蛋白在6–638氨基酸区域含有HtpG保守结构域，属于HtpG超家族。通过NCBI BLASTP筛选其他植物的10个HSP83A同源蛋白序列并构建系统发育树，结果显示芒果HSP83A与黄连木（Pistacia vera）HSP83A聚在同一分支，自举支持率为76%，表明两者亲缘关系密切。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出，结合基因组变异分析和抗性表型鉴定是筛选作物抗病相关位点的有效途径。本研究联合转录组和全基因组重测序数据，优先筛选位于抗病相关基因外显子区、可能引起氨基酸改变且在两品种中呈不同纯合基因型的非同义SNP，最终获得86个候选SNP，其中37个可形成清晰稳定的基因型聚类，表明多数据集联合分析可有效缩小候选位点范围。SNP26在25份材料的初步筛选、322份种质的扩大群体分型及72份材料的抗性评价中均表现出与抗性表型的一致性，具有初步筛选芒果细菌性角斑病抗性种质的潜力，但该病害可能受多基因和环境条件影响，未来仍需在更大群体和多点多年份中进一步评估该标记的准确性和适用范围。SNP26位于HSP83A基因编码区，其碱基变异可引起相应氨基酸改变，保守结构域分析表明HSP83A蛋白含有HSP90/HtpG家族保守结构域。HSP90作为ATP依赖性分子伴侣，可与RAR1和SGT1形成复合物，参与免疫受体稳定性和植物防御信号传递，且近期研究表明HSP90参与木薯与黄单胞杆菌的互作，为解析芒果HSP83A的潜在抗病功能提供了理论基础。Xcm侵染后HSP83A在抗感品种中的差异表达模式及系统发育分析结果，为SNP26作为抗性相关KASP标记提供了生物学依据，但其具体作用仍需通过遗传分离、群体共分离分析和基因功能验证进一步确认。

研究结论为：本研究鉴定出86个与芒果细菌性角斑病抗性相关的候选SNP，其中37个成功转化为具有清晰稳定基因型聚类的KASP标记。在这些标记中，位于15号染色体1,299,510位点的SNP26与25份芒果种质的已知抗性表型高度一致，并将322份芒果种质分为两个不同的基因型组。通过人工果实接种对72份芒果种质进行抗性评价，揭示了病害反应的显著变异并将测试种质划分为5个抗性等级，为评估SNP26标记提供了额外的表型支持。Sanger测序进一步证实了抗性品种‘热农1号’与感病品种‘凯特’之间的A/G多态性。SNP26位于HSP83A基因编码区内并导致氨基酸替换。上述发现表明，SNP26是一个有应用前景的抗性相关标记，可用于芒果细菌性角斑病抗性种质的初步鉴定，并可能有助于芒果育种中的分子标记辅助选择。该标记的预测准确性和更广泛的适用性仍需在独立群体和不同环境中进一步验证。