寒地粳稻籽粒蛋白含量全基因组关联定位与单倍型分析

《Plants》：Genome-Wide Association Mapping of Grain Protein Content and Haplotype Analysis in Cold-Region Japonica Rice

　　

籽粒蛋白含量（Grain Protein Content, GPC）是决定水稻营养品质和食味品质的重要因素。本研究对624份寒地粳稻种质资源在哈尔滨民主、乌兰浩特以及松嫩平原盐碱地的GPC和食味值进行了评估，其中495份具有完整表型和基因型数据的材料被用于全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study, GWAS）。GPC在各试验地点间呈显著正相关，其基于均值的广义遗传力（entry-mean broad-sense heritability）为0.663。利用1,527,603个高质量SNP标记，通过GLM-Q模型共鉴定出56个与GPC显著关联的SNP，主要分布于第11号和7号染色体，且呈现地点特异性模式。对GLM-Q显著SNP进行注释，获得28个非冗余的位置候选基因。在GEMMA模型中，第11号染色体的信号未达到全基因组显著性水平，而第7号染色体的关联仍保持显著。Os11g0239500、Os11g0239900、Os07g0264100和Os03g0244200的单倍型在GPC和食味值上存在差异。对Os11g0239500和Os07g0264100进行联合单倍型分析，将319份材料划分为四种类型。第IV类型的平均GPC最低（7.84%），平均食味值最高（81.14），而第I类型的平均GPC为8.78%，平均食味值为77.45。所鉴定的候选基因和单倍型可用于筛选低GPC和高食味品质的寒地粳稻品种。

研究背景与科学问题

水稻籽粒蛋白含量（Grain Protein Content, GPC）是衡量稻米营养品质和食味品质的关键指标。过高的GPC通常会导致米饭硬度增加、适口性下降。尽管前人已克隆了多个调控GPC的基因，如编码氨基酸转运蛋白的OsAAP6、影响谷蛋白前体积累的OsGluA2等，但这些基因的效应常因遗传背景和种植环境而异。寒地粳稻经过长期对早熟、耐冷、稳产和优良食味的选择，形成了独特的遗传背景，但其GPC变异的遗传基础尚不清晰。特别是，主要GPC关联位点在不同生产环境下是否表现一致，以及这些区域的自然变异是否同时影响GPC和食味品质，仍有待阐明。为此，研究人员开展了此项研究，旨在鉴定与降低GPC和改善食味品质相关的有利遗传变异，为寒地粳稻的品质育种提供单倍型资源。

研究内容与结论

研究人员利用624份寒地粳稻种质，在三个试验地点（哈尔滨民主、乌兰浩特、松嫩平原盐碱地）评估了GPC和食味值，并对其中495份具有完整表型和基因型数据的材料进行了全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study, GWAS）、候选基因注释及单倍型分析。主要结论包括：鉴定出56个与GPC显著关联的SNP，主要集中于第11号和7号染色体，且呈现地点特异性；通过单倍型分析发现Os11g0239500、Os11g0239900、Os07g0264100和Os03g0244200四个候选基因的不同单倍型与GPC和食味值显著相关；对Os11g0239500和Os07g0264100进行联合单倍型分类后，第IV类型材料表现出最低的平均GPC（7.84%）和最高的平均食味值（81.14），显著优于第I类型（GPC 8.78%，食味值77.45）。该研究揭示了寒地粳稻GPC的遗传结构，并为培育低蛋白高食味的水稻品种提供了有价值的分子标记和单倍型资源。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：1）田间试验设计：于2023年在黑龙江省哈尔滨市民主、内蒙古自治区乌兰浩特市以及兴安盟盐碱地三个地点设置试验，每份材料设三次独立田间重复。2）表型测定：利用JSWL-200型大米食味计（基于近红外光谱技术）测量脱壳精米后的GPC和食味值，并以凯氏定氮法验证GPC数据的可靠性。3）全基因组重测序与变异检测：对供试材料进行约10×深度的全基因组重测序，将过滤后的读段比对至日本晴参考基因组（IRGSP-1.0），使用GATK HaplotypeCaller进行SNP和InDel calling，经严格质控后保留1,527,603个高质量SNP用于后续分析。4）群体结构与连锁不平衡分析：使用ADMIXTURE软件分析群体结构，基于主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和亲缘关系矩阵评估遗传关系，并通过PopLDdecay估算连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）衰减距离约为300 kb。5）GWAS与候选基因鉴定：分别采用TASSEL软件的GLM-Q模型（以群体结构Q矩阵为协变量）和GEMMA软件的线性混合模型进行关联分析，以?log₁₀(p) > 7.5为显著性阈值，对显著SNP进行注释后获得28个非冗余的位置候选基因。6）单倍型分析：基于候选基因及其侧翼区域的多态性SNP定义单倍型，采用单因素方差分析比较不同单倍型间的GPC和食味值差异，并使用线性混合模型（纳入前五个主成分和VanRaden基因组亲缘矩阵）进行群体校正的敏感性分析。

研究结果

2.1 GPC的表型变异

495份材料的GPC在三个地点均呈连续分布，均值分别为8.48%（哈尔滨民主）、7.73%（乌兰浩特）和8.70%（盐碱地），变异系数介于8.62%至9.70%之间，表明群体内存在丰富的表型变异。GPC在三个地点间呈显著正相关（Pearson相关系数0.554~0.593），基于多环境混合模型的广义遗传力为0.663。

2.2 群体结构与连锁不平衡

经质控后保留1,527,603个高质量SNP。ADMIXTURE交叉验证显示K=15时误差最小，故以此表征群体结构。LD衰减距离约为300 kb。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）的前三个主成分分别解释了总遗传变异的14.31%、7.10%和4.48%，揭示群体呈整体连续分布但存在两个主要遗传类群。亲缘关系分析显示大部分材料间亲缘关系较低。

2.3 GPC的全基因组关联分析

以?log₁₀(p) > 7.5为阈值，GLM-Q模型共鉴定出56个显著SNP，其中31个来自哈尔滨民主、19个来自乌兰浩特、6个来自盐碱地。显著SNP分布于第3、6、7、10和11号染色体，多数集中在第11号染色体（30个）和第7号染色体（23个）。在哈尔滨民主，第11号染色体显著SNP集中于7.43~7.50 Mb区间；而在乌兰浩特和盐碱地，关联信号主要位于第7号染色体。GEMMA分析中，第11号染色体信号不再显著，但第7号染色体的关联在所有三个地点均保持显著。对GLM-Q显著SNP进行注释，获得28个非冗余位置候选基因，其中Os11g0239500、Os11g0239900、Os07g0264100和Os03g0244200被选为代表基因进行深入分析。

2.4 候选基因的单倍型分析

四个候选基因的单倍型效应呈现地点依赖性。对于第11号染色体的Os11g0239500，其Hap2、Hap3和Hap4在哈尔滨民主表现出较低的GPC（约7.98%~8.05%）和较高的食味值（约80.12~80.42）。Os11g0239900的Hap1在哈尔滨民主具有最低的GPC（8.27%）和最高的食味值（79.83）。对于第7号染色体的Os07g0264100，其单倍型效应在乌兰浩特最为明显：Hap1的GPC（7.43%）显著低于Hap2（8.04%），食味值则相反（80.26 vs. 78.10）。Os03g0244200的Hap7具有最低的GPC（7.78%），但低GPC和高食味值并未集中在一个主要单倍型中。群体校正的敏感性分析确认了Os11g0239500在哈尔滨民主、Os07g0264100在乌兰浩特的显著关联。

2.5 已知基因的单倍型分析

对五个已知品质相关基因（Wx/OsGBSS、ALK/OsSSIIa、OsBADH2/fgr、qPC1/OsAAP6、qPC-10/OsGluA2）的分析显示，其单倍型效应同样因基因和地点而异。例如，qPC-10/OsGluA2的Hap2在哈尔滨民主表现出显著低于Hap1的GPC和高于Hap1的食味值。总体而言，已知基因的功能预测并不足以完全解释其在寒地粳稻群体中的表型效应。

2.6 Os11g0239500和Os07g0264100的联合单倍型分类

基于单基因分析结果，将319份材料按Os11g0239500和Os07g0264100的单倍型组合分为四类（Type I~IV）。Type IV（携带Os11g0239500的有利单倍型Hap2/Hap3/Hap4和Os07g0264100的有利单倍型Hap1/Hap3）在所有三个地点均表现出最低的平均GPC（7.84%）和最高的平均食味值（81.14），而Type I（不利单倍型组合）的对应值分别为8.78%和77.45。六个地点-性状的Type IV vs. Type I比较经Holm校正后均极显著（p < 0.001）。群体校正的敏感性分析进一步支持了Type IV在哈尔滨民主的显著优势。

讨论与结论

讨论部分总结：本研究发现GPC的主要关联信号呈现明显的环境依赖性：哈尔滨民主的关联信号集中于第11号染色体，而乌兰浩特和盐碱地的信号主要位于第7号染色体。这种差异可能部分源于环境条件的变化，但研究并未正式检验SNP×地点的交互作用。第7号染色体的关联在GEMMA模型中稳健存在，而第11号染色体的信号对模型选择敏感，需谨慎解读。单倍型分析结果与关联信号的分布一致，且Os07g0264100的关联在群体校正后仍稳健。已知GPC相关基因（如OsAAP6、OsGluA2）在本群体中的效应不完全保守，表明长期育种选择可能改变了等位基因频率和组合。联合单倍型分析揭示了Type IV的优异表型趋势，但该观察不能解释为两位点间的加性或上位效应，且统计支持程度随地点和群体校正而变化。研究局限性包括数据仅来源于2023年一个生长季，关联的稳定性需多年多点验证。

研究结论：本研究对一个寒地粳稻群体的籽粒蛋白含量（GPC）遗传变异进行了系统鉴定。全基因组关联分析确定了第11号和7号染色体上的主要GPC关联区段，单倍型分析突出了Os11g0239500、Os11g0239900、Os07g0264100和Os03g0244200作为候选基因的价值。对Os11g0239500和Os07g0264100的联合单倍型分析表明，Type IV比Type I具有更低的GPC和更高的食味值，且在哈尔滨民主观察到显著的校正后差异。这些结果为GPC关联区段和单倍型模式的深入研究提供了依据。未来需要在独立群体中进行功能验证和评估，以确定其对水稻育种的潜在价值。