长期免耕与传统耕作及氮肥施用对硬质小麦籽粒品质及肠道细胞响应的影响

《Plants》：Effects of No-Tillage Versus Conventional Tillage and Nitrogen Fertilization on Durum Wheat Grain Quality and Intestinal Cell Responses

　　

摘要 背景： 保护性农业（conservation agriculture）已成为一种改善土壤质量、同时维持作物生产力与籽粒营养价值的可持续策略。然而，关于农艺措施如何影响硬质小麦（durum wheat）籽粒生物活性的信息仍然有限。本研究在PFRLab项目框架内开展，旨在探讨免耕（no-tillage，NT）与传统耕作（conventional tillage，CT）在两种氮肥水平（0和180 kg ha?1 N）下对硬质小麦籽粒品质及Caco-2肠道上皮细胞生物学响应的影响。方法： 通过测定蛋白质、叶黄素（lutein）及矿物质含量评价籽粒品质。采用MTT法测定Caco-2细胞活力，并利用H2DCFDA衍生荧光检测孵育3、24和48 h后细胞内氧化活性，以评估籽粒提取物的生物活性。结果： 施用氮肥条件下籽粒蛋白质和叶黄素含量趋于升高，而耕作制度间在所测组成性状上的差异一致性较低。相比之下，细胞学检测呈现出明显差异。NT来源提取物总体上较CT来源提取物维持更高的Caco-2细胞活力，尤其在24和48 h时更为显著；而CT来源提取物通常诱导更高的H2DCFDA衍生细胞内荧光。氮肥施用对两种细胞学终点均产生影响，其效应随孵育时间和耕作制度而异。相关性分析显示，在各单独孵育时间点，细胞内荧光与细胞活力之间呈负相关但未达显著水平（3 h时r = ?0.649，24 h时r = ?0.353，48 h时r = ?0.198）。结论： 这项探索性初步研究的结果表明，在地中海条件下，长期免耕可将所测硬质小麦籽粒品质性状维持在与传统耕作相当的水平，同时农艺管理也与籽粒提取物生物活性的差异相关联。细胞学发现提供的是补充性信息，而非直接健康效应或特定化学机制的证据。未来研究若整合籽粒提取物的靶向植物化学表征、土壤微生物分析及互补性细胞学方法，将有助于阐明农艺管理、籽粒组成与生物活性之间的关系。

论文解读：长期免耕与传统耕作及氮肥施用对硬质小麦籽粒品质及肠道细胞响应的影响

一、研究背景与问题提出

随着世界人口持续增长和气候变化压力日益加剧，农业系统必须在提高产量的同时改善可持续性。硬质小麦（Triticum turgidum L. subsp. durum）作为地中海盆地数百万人口重要的热量、蛋白质和微量营养素来源，是全球硬质小麦种植的主要区域，意大利则是全球最大的硬质小麦生产国之一。为可持续地满足未来粮食需求，保护性农业（conservation agriculture，CA）策略，包括免耕（no-tillage，NT）和优化施肥策略，已被广泛研究。CA旨在通过保持永久性土壤覆盖、减少土壤扰动和促进作物多样性来提升生态和经济绩效。与传统耕作（conventional tillage，CT）相比，这些措施可改善土壤健康，并通过降低燃料使用和增强碳固存减少温室气体排放。

已有研究表明，耕作制度和施肥措施显著影响小麦籽粒品质性状，如蛋白质浓度、面筋特性、矿物质组成及其他营养成分。在地中海和温带条件下，CT通常较NT提高籽粒蛋白质浓度，可能源于耕作土壤中氮（nitrogen，N）矿化和养分有效性的增强；而NT系统可能因表层残茬氮释放较慢而影响氮吸收和籽粒品质参数。然而，这些响应高度依赖具体情境，受土壤肥力状况、施肥制度和环境条件影响。此外，耕作和氮肥施用还可能通过长期影响土壤物理、化学和生物学性质间接影响作物表现和籽粒品质。本研究所用同一长期试验点的证据表明，NT和CT产生了不同的土壤物理化学条件，并改变了活跃细菌群落，包括参与氮转化的微生物类群。长期NT与更高的土壤有机碳和全氮相关，而土壤孔隙度的差异促成了不同活跃细菌群落的形成。后续研究进一步证实，土壤管理也影响了硬质小麦的氮和叶绿素状况。

尽管有大量证据表明长期耕作和氮管理可改变土壤性质、养分动态、微生物群落和作物氮状况，但这些农艺效应是否不仅反映在常规硬质小麦籽粒品质性状上，还反映在籽粒衍生化合物的生物活性上，仍不清楚。虽然Caco-2模型已被用于研究谷物衍生化合物的生物活性和生物可及性，但很少有研究在同一实验框架内整合长期农艺管理、籽粒组成和肠道细胞响应。因此，本研究在PFRLab项目框架内开展，旨在探讨长期NT和CT系统与氮肥施用的交互作用对地中海生长条件下硬质小麦籽粒品质的影响，并在常规品质性状之外，通过Caco-2肠道上皮细胞的代谢活力和H₂DCFDA衍生细胞内荧光评估籽粒提取物的生物活性，以确定长期作物管理相关的差异是否延伸至常规组成性状之外。

二、研究内容与主要结论

研究在意大利中部安科纳省阿古利亚诺的马尔凯理工大学“Pasquale Rosati”实验农场开展，该试验点位于地中海气候条件下的山坡上，土壤为粉质黏土，分类为钙积潜育雏形土（Calcaric Gleyic Cambisol）。该试验点属于1994年建立的长期雨养田间试验，采用硬质小麦与玉米（Zea mays L.）两年轮作制度，按裂区设计（split-plot design）布置，设两个独立田间区组（上坡和下坡），土壤耕作作为主区因子，氮肥施用（0和180 kg N ha^?1）作为副区因子。CT处理每年进行约40 cm深度的铧式犁耕翻，随后进行两次圆盘耙整地；NT处理保持土壤不扰动，作物残茬保留于地表，播前进行杂草防除并采用直接播种方式。每个农艺处理从两个独立田间区组采集籽粒样本，每个处理获得两个独立田间水平重复（n = 2）。

研究得出以下主要结论：长期免耕在地中海条件下可将所测硬质小麦籽粒品质性状维持在与传统耕作相当的水平，而氮肥施用下籽粒蛋白质和叶黄素含量趋于升高。互补性细胞学分析显示，不同耕作制度下获得的籽粒提取物诱导了不同的体外响应，NT来源提取物通常与更高的Caco-2细胞代谢活力和更低的H₂DCFDA衍生细胞内荧光相关，而CT来源提取物则相反。这些细胞学响应应被视为籽粒提取物生物活性的补充描述指标，而非直接健康效应的证据。该探索性初步研究为长期耕作和氮管理与硬质小麦籽粒特性（超出所测组成性状）之间可能存在的关联提供了初步证据。

三、主要关键技术方法

研究采用了以下主要技术方法：田间试验采用裂区设计，设两个独立区组，耕作制度为主区因子、氮肥水平为副区因子，每个处理两个田间重复。籽粒蛋白质含量采用凯氏定氮法（Kjeldahl method）测定总氮，按5.7的氮-蛋白转换系数计算。总叶黄素采用热皂化结合溶剂萃取后，经高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）在C18反相柱上等度分离，450 nm波长检测定量。矿物质含量采用王水酸消解后经电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma-optical emission spectrometry，ICP-OES）测定。生物活性评估采用人结肠腺癌细胞系Caco-2（ATCC HTB-37），以10 μg mL^?1浓度的籽粒水提物处理细胞，分别于3、24和48 h通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）法测定细胞代谢活力，以及通过H₂DCFDA（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯）荧光探针测定细胞内氧化活性。统计分析采用裂区方差分析（split-plot ANOVA）和Pearson相关分析。

四、研究结果

4.1 耕作制度与氮肥施用对籽粒品质的影响

籽粒蛋白质含量、叶黄素浓度和矿物质组成在不同耕作制度和氮肥水平下呈现不同模式。在未施肥条件下（0 kg ha^?1 N），NT小麦蛋白质含量（13.17 ± 1.34%）略高于CT（12.65 ± 1.23%）。在180 kg ha^?1 N下，两种耕作制度的蛋白质含量均升高，NT达14.24 ± 1.41%，CT达14.20 ± 1.43%。叶黄素浓度呈现相似模式：0 kg ha^?1 N下NT为0.17 ± 0.01 μg g^?1 DW，CT为0.15 ± 0.02 μg g^?1 DW；氮肥施用后两种耕作制度下均升高，180 kg ha^?1 N时NT达0.21 ± 0.03 μg g^?1 DW，CT为0.18 ± 0.02 μg g^?1 DW。矿物质组成方面，铜（Cu）含量在0 kg ha^?1 N下NT为2.65 ± 0.23 mg kg^?1，CT为3.37 ± 0.31 mg kg^?1，180 kg ha^?1 N时分别增至3.35 ± 0.32和3.51 ± 0.35 mg kg^?1。锰（Mn）浓度在两种氮水平下均表现为CT高于NT：0 kg ha^?1 N下NT为9.22 ± 0.91 mg kg^?1，CT为14.25 ± 1.26 mg kg^?1；180 kg ha^?1 N下NT为8.64 ± 0.83 mg kg^?1，CT为12.80 ± 1.06 mg kg^?1。硒（Se）含量在未施肥条件下较低（NT为0.03 ± 0.004 mg kg^?1，CT为0.06 ± 0.007 mg kg^?1），180 kg ha^?1 N时略有升高（NT为0.04 ± 0.005 mg kg^?1，CT为0.04 ± 0.006 mg kg^?1）。总体而言，氮肥施用趋于提高蛋白质含量和叶黄素浓度，而矿物质组成呈现元素特异性趋势。

4.2 耕作制度与氮肥施用对Caco-2细胞活力的影响

Caco-2细胞代谢活力随孵育时间和硬质小麦农艺管理而变化。3 h孵育后，NT来源提取物较CT来源提取物维持更高的细胞活力，但耕作主效应未达统计显著（p = 0.072）；氮肥施用显著影响细胞活力（p = 0.011），耕作与氮肥交互作用不显著（p = 0.083）。24 h后，所有提取物处理组的细胞活力均低于未处理对照；耕作（p = 0.010）和氮肥施用（p = 0.043）均表现出显著主效应，交互作用不显著（p = 0.965），NT来源提取物总体上较CT维持更高活力。48 h后，所有提取物处理组细胞活力进一步下降，NT来源提取物继续显示较CT更高的活力；耕作（p = 0.027）和氮肥施用（p = 0.022）均具显著效应，交互作用不显著（p = 0.169）。总体表明，耕作制度和氮肥施用均与Caco-2代谢活力差异相关，且效应在延长暴露时间后更为明显。

4.3 耕作制度与氮肥施用对Caco-2细胞内氧化活性的影响

Caco-2细胞暴露于硬质小麦籽粒提取物后，H₂DCFDA衍生细胞内荧光升高，响应随孵育时间、耕作制度和氮肥施用而变化。3 h孵育后，所有籽粒提取物处理的荧光值均高于未处理对照；农艺处理中NT–N0荧光最低，CT–N180最高；CT来源提取物通常较NT显示更高荧光，但耕作主效应未达显著（p = 0.051）；氮肥施用显著影响细胞内荧光（p = 0.001），交互作用不显著（p = 0.389）。24 h后，所有实验组荧光均升高；农艺处理中NT–N0荧光最低，依次为NT–N180、CT–N180和CT–N0；耕作主效应仍略高于显著阈值（p = 0.051），氮肥施用（p < 0.001）和耕作与氮肥交互作用（p < 0.001）显著，交互作用反映两种耕作制度下对氮肥施用的响应不同——NT下荧光升高而CT下略有降低。48 h后，细胞内荧光在所有处理中达最高值；NT–N0继续显示最低荧光，依次为NT–N180、CT–N0和CT–N180；耕作（p = 0.030）、氮肥施用（p = 0.002）及交互作用（p = 0.005）均显著，表明氮肥响应在两种耕作制度间存在差异。总体而言，H₂DCFDA衍生荧光随孵育时间增加而升高，CT来源提取物通常较NT诱导更高荧光；氮肥施用影响细胞氧化响应，但其效应取决于耕作制度和孵育时间。

4.4 H₂DCFDA衍生细胞内荧光与Caco-2细胞活力之间的关系

Pearson相关分析显示，3 h时细胞内荧光与细胞活力呈中等负相关（r = ?0.649，R² = 0.421），但未达统计显著（p = 0.082）；24 h时负相关减弱（r = ?0.353，R² = 0.125；p = 0.391）；48 h时相关性进一步减弱（r = ?0.198，R² = 0.039；p = 0.637）。将所有孵育时间点的观测值合并后，呈现强负相关（r = ?0.821，R² = 0.674；名义p < 0.001）。总体结果表明H₂DCFDA衍生荧光与Caco-2代谢活力之间存在负相关，但各单独时间点的相关性未达统计显著。

五、讨论与结论

讨论部分指出，与既往研究一致，籽粒蛋白质含量和叶黄素浓度在氮肥施用下趋于升高，而耕作制度间的差异在可比氮水平下一致性较低。氮有效性已知强烈调控硬质小麦籽粒中氮同化和贮藏蛋白合成，尤其在地中海土壤氮矿化常为限制因素的条件下。NT与CT在可比氮水平下蛋白质和叶黄素值相对接近，与长期保护性农业试验证据一致，即经过初始过渡期后，NT可将籽粒品质维持在CT相当水平。N180处理采用的较高氮肥施用量（180 kg N ha^?1）可能部分补偿了NT下有机质分解和氮矿化较慢的约束，从而促成两种耕作制度在相同施肥水平下籽粒品质性状的可比性，但该机制未在本研究中直接评估。叶黄素浓度在氮肥施用下趋于升高，而耕作制度间差异较小，类胡萝卜素生物合成与籽粒灌浆期氮状况和光合能力相关，土壤扰动本身在土壤肥力稳定后作用次要。矿物质组成呈现元素特异性模式，锰在两种氮水平下均表现为CT均值高于NT，矿物质吸收和籽粒装载受土壤-植物相互作用的复杂调控，在长期耕作试验中这些过程可能随时间趋于缓冲。研究还讨论了长期耕作和氮管理可能通过土壤-微生物-植物连续体间接影响籽粒品质的途径，但本研究中未直接调查土壤微生物群落。

关于细胞学结果，虽然不同耕作制度下获得的籽粒提取物诱导了不同的细胞响应，但造成这些差异的化学组分尚未确定。叶黄素是在皂化和有机溶剂萃取后定量的，而用于细胞处理的提取物采用含1%乙醇的去离子水制备，鉴于叶黄素水溶性有限，其对本研究观察到的细胞响应的贡献无法确定。这些响应可能反映水溶性或弱极性组分（包括可溶性酚类化合物和其他氧化还原活性分子）的差异，但这些化合物未在细胞提取物中直接表征。相关性分析显示各孵育时间点细胞内荧光与细胞活力均呈负相关但单独评估时均未达显著，合并数据集的强负相关应谨慎解读，因其可能部分反映孵育时间之间的差异。研究局限性包括仅测试了一个提取物浓度、未进行模拟胃肠消化、仅评估了代谢活力和H₂DCFDA衍生荧光而未设特异性阳性氧化应激对照，以及原始区组特异性籽粒组成数据不可用导致无法对这些性状进行裂区推断分析。

研究结论翻译如下：总之，在地中海条件下，长期免耕将所测硬质小麦籽粒品质性状维持在与传统耕作相当的水平，而籽粒蛋白质和叶黄素含量在氮肥施用下趋于升高。这些发现支持保护性农业在所研究条件下保持硬质小麦籽粒品质的潜力。互补性细胞学分析显示，不同耕作制度下获得的籽粒提取物诱导了不同的体外响应，NT来源提取物通常与更高的Caco-2细胞代谢活力和更低的H₂DCFDA衍生细胞内荧光相关，而CT来源提取物则相反。这些细胞学响应应被视为籽粒提取物生物活性的补充描述指标，而非直接健康效应的证据，特别是因为这些差异的具体籽粒组分尚未确定。总体而言，这项探索性初步研究提供了初步证据，支持长期耕作和氮管理可能影响硬质小麦籽粒特性（超出所测组成性状）的假说，可能促成Caco-2细胞中观察到的不同体外响应。未来研究若将土壤和根际微生物表征与籽粒提取物靶向植物化学分析、模拟胃肠消化、剂量-响应实验及额外细胞学终点相结合，将有助于阐明长期农艺管理、籽粒组成与生物学特性之间的关系，为制定兼顾农艺表现和籽粒品质的可持续种植策略提供支持。