氮素配施与盐溶液对蓝莓生理、微形态及生化组分的影响

《Plants》：Nitrogen Fertilization and Saline Solution on the Physiology, Micromorphology and Biochemical Components of Blueberry

　　

氮素配方与咸水灌溉可能影响蓝莓（blueberry）的生理特性、气孔特征及果实组分。本研究在保护地栽培条件下，以椰糠（coconut fiber）为基质栽培‘Biloxi’蓝莓，评价了4种NH₄⁺–NO₃^?–N配方（100:0、75:25、0:100和25:75）在2种盐度条件（0和30 mM NaCl）下的效应，并额外设置不含NaCl的50:50对照。盐处理通过每周以30 mM NaCl灌溉实施。每处理选取3株独立植株测定叶片气体交换，每处理4株评价气孔微形态。果实总糖（total sugars）和抗坏血酸（ascorbic acid）由每处理单一混合样品进行描述性测定。净光合速率（net photosynthetic rate，A）、气孔导度（stomatal conductance，gs）、胞间CO₂浓度（intercellular CO₂ concentration，Ci）和蒸腾速率（transpiration rate，E）均存在显著的配方×盐度交互作用。盐度降低了100:0、0:100和25:75配方下的A，而75:25配方下A由2.733增至4.500 μmol CO₂ m^?2 s^?1。氮素配方显著影响气孔指数（stomatal index）和气孔密度（stomatal density），而盐度及其与配方的交互作用对所评价的微形态性状均不显著。总糖和抗坏血酸在各处理间表现出描述性差异，但无法确立生物学处理效应。上述结果表明，蓝莓对间歇性咸水灌溉的生理响应具有配方依赖性，并强调在解释蓝莓响应时需考虑完整的养分组成。

蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）因其营养与生化特性，尤其是糖组分和抗氧化相关化合物而受到重视。无土基质保护地栽培为调控养分供应和灌溉条件提供了可能，但蓝莓的生理与生化响应取决于营养因素与环境因素的相互作用。氮（N）是蓝莓生长和光合代谢的必需元素，其无机形态可差异性地影响植株响应。尽管蓝莓常表现出对铵（NH₄⁺）的偏好，但氮素营养效应随养分浓度和栽培条件而变化。Cárdenas-Navarro等报道，以6.0 mM NH₄⁺形式供氮的蓝莓光合活性更高并表现出多种生长响应；相反，Anwar等发现无土栽培下50:50的NH₄⁺–NO₃^?–N比例有利于光合与生长。氮素营养还可能影响叶片表皮发育和气孔特征，Yang等观察到不同氮形态下蓝莓幼苗气孔尺寸存在差异，Sathee和Jain记录了小麦中与氮素营养相关的气孔解剖变化，Benevenute等进一步证实蓝莓基因型间气孔形态的可变性，强调区分气孔密度与气孔尺寸的重要性。盐度是蓝莓生产的另一挑战，可破坏植株水分关系、离子稳态和光合过程；与硫酸铵施肥相关的盐分条件已被认为会降低蓝莓生长，Ma等记录了不同蓝莓品种对氯胁迫的生理响应差异，氯还可能干扰硝酸盐的吸收与利用。氮素管理和盐分条件可能影响果实生化组成：Okan等描述了蓝莓品种间糖组分的变异，Duan等报道黑莓果实中糖和维生素C随氮形态变化，Bola?os-Alcántara等则考察了‘Biloxi’蓝莓中氮比例和电导率与果实品质的关系。此前采用同一试验系统的研究已评价了氮素配方和盐度对‘Biloxi’蓝莓营养生长、开花、产量及果实物理品质性状的影响，但未报道叶片气体交换、气孔微形态及果实总糖和抗坏血酸含量。本研究针对这些互补的响应变量，以更全面地刻画蓝莓对养分配方和间歇性咸水灌溉的响应。因此，本研究旨在评价4种名义NH₄⁺–NO₃^?–N配方（100:0、75:25、0:100和25:75）以及0或30 mM NaCl间歇灌溉对保护地椰糠栽培‘Biloxi’蓝莓叶片气体交换和气孔微形态的影响，并额外纳入不含NaCl的50:50配方作为对照，同时对果实总糖和抗坏血酸含量进行描述性表征。研究人员假设生理和微形态响应会因养分配方及其与咸水灌溉的组合而不同。

研究结果表明，双因素方差分析显示氮素配方（F）与NaCl盐度（S）对A（F = 54.65，p < 0.0001）、gs（F = 3.45，p = 0.0417）、Ci（F = 4.36，p = 0.0200）和E（F = 5.80，p = 0.0070）存在显著交互作用；氮素配方显著影响A（p < 0.0001），盐度对A（p < 0.0001）、Ci（p = 0.0075）和E（p = 0.0497）有显著主效应，因此生理响应主要在各盐度水平内比较氮素配方以及在各配方内比较盐度条件。在无外加NaCl条件下，0:100和25:75配方的A最高，分别为5.260和4.723 μmol CO₂ m^?2 s^?1且二者无显著差异，而100:0和75:25配方较低，分别为3.670和2.733 μmol CO₂ m^?2 s^?1；在30 mM NaCl下响应格局明显改变，75:25配方A最高（4.500 μmol CO₂ m^?2 s^?1）并显著高于其他配方，100:0和25:75配方最低（分别为1.397和1.717 μmol CO₂ m^?2 s^?1），0:100配方居中（2.667 μmol CO₂ m^?2 s^?1）。各配方内盐度比较显示，30 mM NaCl使100:0、0:100和25:75配方的A分别降低约61.9%、49.3%和63.7%，而75:25配方显著增加约64.6%（由2.733增至4.500 μmol CO₂ m^?2 s^?1），4项比较经Holm校正后均显著（p < 0.05），这解释了配方与盐度对净光合的显著交互作用。gs亦存在显著配方×盐度交互作用（p = 0.0417），但两因素均无显著主效应：无NaCl时0:100配方数值最高（0.0847 mmol H₂O m^?2 s^?1），75:25最低（0.0469 mmol H₂O m^?2 s^?1）；盐分下75:25数值最高（0.0717 mmol H₂O m^?2 s^?1），25:75最低（0.0317 mmol H₂O m^?2 s^?1），但Tukey检验未在任一盐度条件下检出配方间显著差异，Holm校正后各盐度对比亦均不显著（p > 0.05），故尽管总体交互显著，gs的个别处理组合差异应谨慎解读。Ci受盐度（p = 0.0075）及其与配方交互作用（p = 0.0200）显著影响，配方主效应不显著：非盐条件下Ci为251.7–275.0 μmol CO₂ mol^?1，配方间无显著差异；30 mM NaCl下100:0和25:75配方数值最高（分别为339.3和330.0 μmol CO₂ mol^?1），75:25最低（261.7 μmol CO₂ mol^?1）；配方内比较表明盐度使100:0和25:75配方的Ci分别显著增加78.7和78.3 μmol CO₂ mol^?1（Holm校正p < 0.05），75:25和0:100配方无显著变化。E受盐度（p = 0.0497）和配方×盐度交互作用（p = 0.0070）显著影响，配方主效应不显著：无NaCl时E为1.707–2.797 mmol H₂O m^?2 s^?1，配方间无显著差异；30 mM NaCl下75:25配方数值最高（2.607 mmol H₂O m^?2 s^?1），25:75最低（1.028 mmol H₂O m^?2 s^?1），二者经Tukey检验差异显著；配方内比较显示盐度使0:100配方E由2.797降至1.507 mmol H₂O m^?2 s^?1、25:75配方由2.590降至1.028 mmol H₂O m^?2 s^?1（Holm校正p < 0.05），100:0和75:25配方无显著盐度效应。额外50:50对照（无NaCl）的A、gs、Ci和E均值分别为3.730 μmol CO₂ m^?2 s^?1、0.0594 mmol H₂O m^?2 s^?1、251.7 μmol CO₂ mol^?1和2.057 mmol H₂O m^?2 s^?1；Dunnett校正比较显示T5和T7光合显著高于对照，T2、T3、T6和T8显著低于对照（p < 0.05），T1和T4与对照无显著差异，Ci仅T2与对照差异显著，gs和E均无显著差异。总体而言，气体交换响应取决于氮素配方与盐度的具体组合，75:25配方在咸水灌溉下A升高而其他3种配方降低的对比尤为明显；尽管gs、Ci和E也存在显著交互作用，但其响应多变且并非所有个别比较均达显著，提示应评价单个养分配方及其对盐度的响应，而非仅依赖氮形态或盐度的主效应。

气孔微形态结果表明，双因素方差分析显示氮素配方显著影响气孔指数（SI；F = 12.33，p < 0.0001）和气孔密度（SD；F = 8.37，p = 0.00055），盐度及配方×盐度交互作用对二者均无显著影响（p > 0.05）；气孔长度（SL）、宽度（SW）、面积（SA）和周长（SP）不受氮素配方、盐度及其交互作用的显著影响。非盐条件下25:75配方SI最高（38.19%），显著高于100:0（25.09%）、75:25（24.46%）和0:100（30.06%）配方；30 mM NaCl下25:75配方SI数值仍最高（33.11%），但仅与100:0配方（25.81%）差异显著，75:25和0:100配方居中。SD呈相似格局：无NaCl时25:75配方SD最高（289.11 stomata mm^?2），显著高于100:0和75:25配方（分别为190.48和200.68 stomata mm^?2），0:100配方居中（251.70 stomata mm^?2）；盐分下SD为207.48–265.30 stomata mm^?2，配方间无显著差异。尽管盐度条件间SI和SD存在数值差异，但均无显著盐度主效应：4种氮素配方平均的SI在0 mM和30 mM NaCl下分别为29.45%和30.13%，SD分别为232.99和238.09 stomata mm^?2，表明咸水灌溉后未检出气孔指数或密度的总体统计显著变化。气孔尺寸在各处理间数值变异有限，9个处理中SL为21.38–23.75 μm、SW为13.94–15.19 μm、SA为231.27–273.46 μm²、SP为58.73–64.55 μm，任一盐度水平内配方间均无显著差异，与这些性状的非显著因子效应一致；这些测量对应整个成对保卫细胞结构而非仅中央气孔孔口。额外50:50对照的SI为32.38%、SD为244.90 stomata mm^?2，Dunnett校正比较显示T3（75:25无NaCl）SI显著低于对照（p < 0.05），SI、SD、SL、SW、SA或SP相对对照均未检出其他显著差异。总体而言，氮素配方显著影响气孔指数和密度，而盐度及配方×盐度交互作用无显著效应，气孔尺寸在各处理组合间统计上相当，表明所观察到的微形态差异主要与气孔频率相关而非保卫细胞尺寸改变。

果实生化描述性结果显示，生化分析揭示总糖（TS）和抗坏血酸（AA）在氮素配方和盐度条件间存在数值差异；由于每处理10株植株的果实被混合为单一复合样品，结果按描述性评价，所报道的均值和标准差代表3次独立分析制备而非生物学重复。8个析因处理间TS为26.49–40.28 mg SE g^?1 DM，最高值见于无NaCl的100:0配方（40.28 mg SE g^?1 DM），最低值见于同一配方30 mM NaCl处理（26.49 mg SE g^?1 DM），描述性降幅约34.2%。TS对咸水灌溉的响应因配方而异：75:25配方TS数值由30.27升至35.45 mg SE g^?1 DM，0:100和25:75配方盐度条件间差异较小（分别为33.66–34.49和32.62–31.55 mg SE g^?1 DM）；额外50:50对照在全部9个处理中TS数值最高（42.35 mg SE g^?1 DM）。AA含量范围相对较窄，为2.261–2.527 mg AA g^?1 DM：100:0配方下咸水灌溉使数值由2.402降至2.261 mg AA g^?1 DM，0:100配方则由2.266升至2.459 mg AA g^?1 DM，75:25和25:75配方在盐度条件间几乎不变；50:50对照AA为2.504 mg AA g^?1 DM，数值上与75:25和25:75配方相当。总体描述性格局表明TS在处理组合间的变异大于AA，但由于这些测定缺乏生物学重复，所观察到的数值差异不能解释为氮素配方、盐度或其交互作用的统计学确立效应。

讨论部分指出，A、gs、Ci和E的显著配方×盐度交互作用表明‘Biloxi’蓝莓的气体交换响应取决于特定养分配方；蓝莓的氮获取与同化受所供无机氮形态及其与植株营养需求相互作用的影响，植株对无机氮形态的偏好取决于相互作用的生理和环境因素。非盐条件下0:100和25:75配方净光合速率最高，但这并不表明硝酸盐具有普遍优越性，因为Cárdenas-Navarro等报道6.0 mM NH₄⁺供氮时光合更高，而Anwar等发现50:50比例有利，提示响应取决于营养配方和试验条件。本研究的生理结果补充了同一试验先前报道的农艺响应：Espinoza-Orozco等发现铵主导处理下生物量、开花、果实产量和产量更高，而本分析中硝酸盐主导配方在非盐条件下瞬时净光合速率更高，二者未必矛盾，因为单一发育阶段测定的叶片气体交换并不直接代表累积碳同化、生物量分配或季节产量。氮同化差异可能促成这些响应：硝酸盐还原涉及硝酸盐还原酶活性并与碳代谢紧密整合，NH₄⁺同化主要通过GS/GOGAT途径，其吸收和分配涉及受调控的铵转运系统，但过量铵供应可能产生生理和营养失衡；这些过程为处理差异提供了可能解释，但本研究未直接评价。咸水灌溉显著降低100:0、0:100和25:75配方的A，而75:25配方呈相反响应；已有研究记录了渗透胁迫对蓝莓性能的不利影响、品种依赖的氯胁迫生理响应以及硫酸铵施肥相关盐分降低蓝莓生长，这些发现支持蓝莓对盐分条件的敏感性，但不能解释75:25配方下光合增加。100:0和25:75配方下A降低与Ci升高同时出现，提示光合限制可能并非完全由气孔导致；已有研究记录了长期盐暴露下叶绿体损伤、叶绿体对盐度的响应以及叶绿体结构改变伴随的光合降低，但本研究未测定叶绿素荧光和叶绿体特征，故无法确认这些机制。尽管gs的配方×盐度交互作用显著，但多重比较校正后个别比较未达显著，故数值变化应谨慎解读；已有研究描述了植物盐分生理响应的复杂性以及水分关系和细胞信号在胁迫响应中的参与。盐度在100:0和25:75配方下升高Ci而降低A，提示CO₂同化下降可能不能仅由气孔限制解释，盐诱导的叶绿体结构和功能改变已有记载，但本研究未测定叶绿素荧光和光合生化能力，非气孔限制仍是一种可能解释。E在0:100和25:75配方下受盐度显著降低，已有研究描述了盐胁迫影响根系吸水和水力调节以及离子稳态和渗透调节在耐盐性中的重要性，但本研究未评价植株水势和水力导度。生理响应还须考虑伴随养分的差异：各配方在钾、钙和硫浓度上存在差异，可能促成所观察到的处理效应，因此响应不能完全归因于NH₄⁺–NO₃^?比例。最后，盐度通过每周以30 mM NaCl灌溉施加并在当日替代营养液，由于未监测基质盐度且处理位置未随机分配，结果应在这些试验限制内解读；总体而言，生理表现取决于特定养分配方和咸水灌溉制度，而非表明任一氮形态具有普遍优势。

气孔微形态讨论指出，氮素配方显著影响‘Biloxi’蓝莓的SI和SD，最高值见于无NaCl的25:75配方；已有研究证明氮形态可影响小麦幼苗叶片表皮和气孔解剖，虽试验条件不同，但支持氮素营养与气孔特征之间的潜在关系。蓝莓中亦有气孔特征差异的报道，Yang等观察到NH₄⁺供应幼苗的气孔长度和宽度大于NO₃^?，而本研究未检出氮素配方对SL、SW、SA或SP的显著影响，这些差异可能与品种、发育阶段和养分配方有关；Benevenute等记录了栽培蓝莓基因型间气孔面积和密度的相当大变异并考察其与辐照响应的关系，尽管本试验仅评价单一品种，但这些发现强调应将气孔密度和大小视为不同的解剖性状。盐度未显著影响SI、SD、SL、SW、SA或SP，也未检出显著配方×盐度交互作用；已有研究描述了非生物胁迫对气孔发育和功能的影响，但本研究缺乏显著差异并不一定表明解剖完全稳定或耐盐，特别是NaCl为间歇施用且未监测根区盐度。气孔特征可通过影响CO₂扩散和水汽运动而影响气体交换，已有研究强调气孔形态、密度与光合性能之间关系的复杂性；本研究中SI和SD的显著差异未始终伴随gs或A的相应差异，因此所观察到的微形态格局不能独立解释生理响应。此外，SL、SW、SA和SP测量的是成对保卫细胞的外部边界而非仅气孔孔口，因此这些变量描述气孔结构但并不直接量化孔口开度或气孔开放，这些尺寸无显著差异不应解释为气孔功能未变。最后，伴随矿质养分（尤其是K、Ca和S）的差异可能促成所观察到的解剖响应，故效应不能完全归因于NH₄⁺–NO₃^?–N比例；总体而言，养分配方与气孔指数和密度的差异相关，而所评价的盐处理未产生统计上可检出的气孔微形态变化。

果实生化组成讨论指出，TS在氮素配方和盐度条件间呈数值变异，最高值见于50:50对照；已有研究记录了蓝莓品种间糖组成的差异以及高丛蓝莓品种间生化品质的相当大差异。在100:0配方下，咸水灌溉伴随TS由40.28降至26.49 mg SE g^?1 DM的数值下降，但其余配方格局不同；Bola?os-Alcántara等评价了‘Biloxi’蓝莓的氮比例和电导率，但未发现总可溶性固形物的显著差异，其发现提供了相关的营养背景，但与本研究的總糖测定不直接可比。氮素营养可能影响浆果作物的碳水化合物积累，Duan等报道铵营养增加黑莓果实糖积累，Anwar等观察到不同NH₄⁺–NO₃^?–N比例下蓝莓叶片可溶性糖和淀粉的变化，但植物种类、取样组织和分析方法的不同妨碍将这些发现直接外推至本研究果实样品。AA在各处理间的数值变异小于TS；Duan等证明氮形态影响黑莓果实维生素C积累，Liu等发现高丛蓝莓品种间维生素C含量差异，这些研究表明抗坏血酸含量可能随营养和生物学条件变化，但本研究结果未确立处理相关效应。生化结果须结合分析方法解读：总糖采用苯酚–硫酸法测定，AA采用改编自Manríquez-Torres等的DCPIP比色法测定，因此测定分别代表蔗糖当量碳水化合物和抗坏血酸，而非单个糖的详细表征或果实完整抗氧化谱。此外，每处理所有10株植株及不同采收日期的果实被合并为单一复合样品，虽进行3次独立分析制备，但它们不构成独立生物学重复，因此TS和AA的数值差异不能视为氮素配方或盐度的统计学证明效应。总体而言，描述性结果提示所评价养分配方和咸水灌溉条件间果实生化组成存在变异，但需采用独立生物样品、受控养分组成和更多生化测定开展进一步研究，以确定这些处理是否稳定改变‘Biloxi’蓝莓果实的糖积累和抗坏血酸含量。

结论部分译文：‘Biloxi’蓝莓对间歇性NaCl灌溉的生理响应取决于养分配方，A、gs、Ci和E均检出显著配方×盐度交互作用；盐度降低100:0、0:100和25:75 NH₄⁺–NO₃^?–N配方下的净光合，而75:25配方呈相反响应。氮素配方显著影响气孔指数和密度，最高数值见于无外加NaCl的25:75配方；但盐度及其与配方的交互作用未显著影响所评价的微形态性状，保卫细胞尺寸亦未检出显著处理效应。果实总糖和抗坏血酸在各处理间呈描述性变异，由于这些测定来自每处理单一复合生物样品，其数值差异不能确立处理相关生化效应。总体而言，结果表明‘Biloxi’蓝莓的生理表现取决于养分配方与咸水灌溉的具体组合；然而，伴随矿质养分的差异、NaCl的间歇施用以及根区盐度监测的缺失，限制了将这些响应完全归因于氮形态或盐度。在确立盐分条件下蓝莓生产的具体施肥建议之前，尚需进一步试验。