水稻高分蘖矮化基因HTD8的图位克隆及其在盐胁迫与PEG模拟渗透胁迫响应中的初步功能解析

《Plants》：Mapping of Rice High-Tillering Dwarf Gene HTD8 and Preliminary Functional Analysis of Its Involvement in Responses to Salt Stress and PEG-Induced Osmotic Stress

　　

水稻（Oryza sativa L.）是全球重要的主食作物，分蘖因其对籽粒产量的关键贡献而成为分子育种的重要靶标。本研究从籼稻品种‘双科早（SKZ）’的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体中分离获得一个高分蘖矮化突变体htd8。该突变体表现为株高降低、分蘖数显著增加、叶片缩短且黄化。与野生型（WT）相比，htd8在株高、节间长度、穗分枝数和千粒重上显著降低，同时分蘖数显著增加。遗传分析表明，htd8表型由单个隐性核基因控制。通过集群分离分析（BSA）测序结合精细定位，候选基因被界定于水稻第11号染色体上0.81 Mb的基因组区间内，其中两个已知的分蘖相关基因D27和ZEBRA2被排除。外源激素测定显示，htd8对外源赤霉素（GA3）敏感性降低，但对独脚金内酯类似物GR24的敏感性增强，且GA3和GR24均能抑制突变体的分蘖发生。在盐胁迫和PEG模拟渗透胁迫下，htd8的存活率显著高于野生型。突变体积累了更多的脯氨酸（Pro），维持了较低水平的丙二醛（MDA），并表现出叶片脱落酸（ABA）含量升高以及ABA生物合成相关基因表达上调。对分蘖芽的转录组分析表明，HTD8通过协调油菜素内酯、生长素、赤霉素和独脚金内酯信号通路以及碳代谢重分配来调控水稻分蘖和株型。该工作为高分蘖矮化的分子机制提供了理论见解，并为高产和耐逆水稻分子育种提供了有价值的遗传资源。

水稻是全球最重要的粮食作物之一，株型是决定产量的关键农艺性状。分蘖数、株高、叶形和粒型共同构成理想株型的核心要素，其中分蘖数直接决定有效穗数，是影响产量的最重要性状之一。分蘖起源于基部未伸长节间上的腋芽，其发育包括分蘖芽起始和伸长两个阶段，受到遗传网络、植物激素和环境信号的精密调控。目前虽已克隆了MOC1、MOC3、LAX1、HTD1、D10、D14和D27等多个调控分蘖和株高的关键基因，但株型调控网络中仍存在大量未表征的位点和分子机制，特别是激素信号、叶绿体发育、抗逆性与分蘖之间的协同调控关系尚待深入阐明。独脚金内酯（SL）和脱落酸（ABA）均源自类胡萝卜素生物合成途径，共享全反式-β-胡萝卜素前体，二者的功能联系不仅限于分蘖调控。ABA是植物响应非生物胁迫的核心激素，而SL与GA途径的交叉对话调控分枝和根系结构，提示参与株型建成的基因可能同时参与胁迫响应途径。目前已发现的能同时调控株高、分蘖、叶片发育和非生物胁迫响应的多功能基因仍较少，其分子调控网络有待深入研究。

研究人员以籼稻品种‘双科早（SKZ）’EMS诱变群体中获得的高分蘖矮化突变体htd8为材料，开展了表型鉴定、农艺性状分析、叶片和叶绿体超微结构观察、外源激素响应测定、PEG模拟渗透胁迫抗性评价、基因定位和分蘖芽转录组分析，旨在阐明HTD8调控分蘖和株高的分子途径及其在PEG诱导渗透响应中的作用。研究得出以下主要结论：htd8突变体表现出典型的矮化多蘖表型，株高显著降低，成熟期分蘖数约为野生型的三倍，叶片变小变窄且叶尖黄化，籽粒长度、宽度和厚度均减小，一次和二次枝梗数减少，千粒重显著低于野生型；突变体叶片气孔密度降低，叶绿体体积变小、形态不规则、类囊体膜结构紊乱，叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和类胡萝卜素（Car）含量均显著低于野生型；htd8地上部分对GA₃不敏感，但对独脚金内酯类似物GR24的敏感性显著增强，GA₃和GR24均能抑制突变体的分蘖发生；在盐胁迫（250 mmol·L^?1 NaCl）和PEG诱导渗透胁迫（20% PEG-6000）下，htd8的存活率显著高于野生型，脯氨酸积累显著增加，丙二醛（MDA）含量显著降低，叶片ABA含量在胁迫处理前即远高于野生型，ABA生物合成相关基因表达显著上调；遗传分析表明htd8受单个隐性核基因控制，BSA测序结合精细定位将HTD8界定于第11号染色体0.81 Mb区间内，排除了已知分蘖相关基因D27和ZEBRA2；转录组分析显示差异表达基因（DEGs）显著富集于色氨酸代谢、苯丙烷生物合成、花青素生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及MAPK信号通路和植物-病原互作等通路，表明油菜素内酯、生长素、赤霉素和独脚金内酯信号通路以及碳代谢的协同扰动介导了htd8的高分蘖表型。

研究人员为开展本研究主要采用了以下关键技术方法：以EMS诱变籼稻品种‘SKZ’获得突变体，通过htd8与粳稻ZH11和TN1杂交构建F₂遗传分离群体用于遗传分析和基因定位；利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察叶片表面和叶绿体超微结构；采用分光光度法测定光合色素含量；通过外源激素（GA₃和GR24）处理幼苗测定株高、根长和分蘖响应；通过盐胁迫和PEG渗透胁迫处理结合存活率统计、脯氨酸和MDA含量测定以及ABA含量检测评估胁迫耐受性；利用集群分离分析（BSA）测序结合InDel标记精细定位候选基因；对分蘖芽进行转录组测序并进行GO和KEGG富集分析；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证基因表达水平。

2.1 茎秆机械强度和细胞壁组分分析：通过系统考察野生型和htd8突变体的关键农艺性状发现，突变体第1和第3节间显著缩短导致株高明显降低，分蘖数在成熟期约为野生型的三倍，叶片较小较窄且叶尖黄化，籽粒长宽厚均减小，一次和二次枝梗数减少，千粒重显著低于野生型。

2.2 突变体叶片表面和叶绿体观察：SEM观察显示野生型单位面积气孔密度和总数高于突变体，而硅化突起密度较低；TEM观察显示突变体叶绿体体积较小、形态不规则、类囊体膜结构紧密紊乱。光合色素分析表明htd8叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著低于野生型，导致蒸腾减弱、光合受抑、叶片生长发育受损。

2.3 外源激素对突变体幼苗生长发育的影响：在1/2 MS培养基上添加不同浓度外源激素培养7天后测定发现，htd8地上部分对GA₃不敏感而根长显著长于野生型；GR24对幼苗地上部分生长的抑制作用随浓度升高而增强，htd8的敏感性显著高于野生型；GR24促进野生型根伸长但抑制突变体根生长；GA₃和GR24均抑制htd8的分蘖形成，表明htd8突变改变了赤霉素和独脚金内酯的响应。

2.4 突变体对非生物胁迫的响应：在250 mM NaCl处理5天和20% PEG-6000处理7天后，htd8的存活率高于野生型，尤其在PEG诱导渗透胁迫下抗性更强。生理测定显示PEG渗透胁迫下htd8脯氨酸积累显著高于野生型，盐和PEG胁迫下MDA含量显著低于野生型，胁迫处理前突变体叶片ABA含量即远高于野生型，ABA生物合成相关基因表达显著上调，表明HTD8可能通过调控ABA生物合成途径介导盐和PEG诱导渗透胁迫响应。

2.5 突变体遗传分析：htd8与ZH11杂交的F₁代表型正常，F₂代121株正常和28株突变表型符合3:1分离比（χ² = 0.38），证实htd8受单个隐性核基因控制。

2.6 htd8的定位：通过htd8与TN1杂交构建F₂群体进行BSA测序，在第11号染色体22 369 198至25 635 987 bp区间检测到主效应峰，利用5个InDel标记将候选区域缩小至0.81 Mb，区间内的D27和ZEBRA2基因经测序和定量分析均无突变。

2.7 转录组功能富集分析：对分蘖芽转录组进行GO富集分析显示DEGs富集于催化活性、糖基键水解酶活性、氧化还原酶活性和纤维素合酶活性等分子功能类别，以及碳水化合物代谢过程、纤维素生物合成过程、类黄酮生物合成过程和防御反应等生物学过程；KEGG富集分析显示DEGs显著富集于色氨酸代谢、苯丙烷生物合成、花青素生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及MAPK信号通路和植物-病原互作等通路。色氨酸代谢通路的显著富集提示突变体中色氨酸介导的生长素相关代谢过程受到明显扰动，可能通过改变顶端优势调节侧芽休眠和萌发状态从而促进分蘖形成；苯丙烷和花青素生物合成通路的富集反映了次生代谢网络的重塑；碳代谢通量再分配为分蘖芽生长发育提供物质支持；脂肪酸代谢相关通路的富集提示独脚金内酯前体代谢受到干扰。

讨论部分指出，htd8的多效性表型包括过度分蘖、矮化、叶绿体发育异常以及盐和PEG诱导渗透胁迫耐受性显著增强，为解析这些复杂性状提供了理想实验体系。htd8的高分蘖矮化表型与一系列SL相关高蘖矮化突变体相似，但htd8对GR24超敏感且GR24抑制其分蘖，表明其分蘖增加并非单纯由于SL缺乏，而可能反映GA和SL信号的偶联。ζ-胡萝卜素异构酶（Z-ISO）功能丧失会降低类胡萝卜素衍生激素水平、损害叶绿体发育和光合作用，并通过降低SL水平增加分蘖，而SL与ABA表现出拮抗作用。htd8叶绿体超微结构异常且叶绿素和类胡萝卜素含量降低，但ABA水平显著升高，提示HTD8可能作用于类胡萝卜素途径的分支点，将前体转向ABA合成而非全面抑制整个途径。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是ABA生物合成的限速酶，SL通过诱导转录因子OsHOX12调控OsNCED1促进ABA合成，该通路具有空间特异性，主要在茎基部发挥作用。NCED受NaCl和PEG强烈诱导，其过表达增强水稻对多种非生物胁迫的耐受性。脯氨酸作为渗透保护剂在胁迫下大量积累，而气孔密度显著降低有助于保水和增强避旱能力，共同促成htd8在PEG渗透胁迫下的高存活率。转录组分析显示htd8中苯丙烷生物合成、花青素生物合成和淀粉蔗糖代谢通路显著富集，表明碳代谢和次生代谢分配发生重编程。SL可抑制单糖转运蛋白OsMST3/6的表达和极性定位，限制分蘖芽对葡萄糖和果糖的摄取从而抑制芽伸长，而蔗糖可抵消SL对水稻分蘖的抑制作用并促进D53蛋白积累，提示碳分配变化可能部分促成htd8分蘖增加。研究局限性包括未测定钠离子和氯离子吸收以确定盐胁迫的主导因素、未评估PSII活性、HTD8尚未克隆导致转录组变化仍为相关性证据。

研究结论：研究人员从‘SKZ’品种的EMS诱变群体中鉴定出一个新的水稻隐性突变体htd8，该突变体表现出矮化、过度分蘖、窄叶黄化、光合受损和籽粒产量降低等多效性表型。突变改变了植物激素响应：htd8对GA₃不敏感但对独脚金内酯类似物GR24超敏感，GA和SL信号通路协同调控分蘖发育。同时，htd8突变体表现出增强的盐和渗透胁迫耐受性，这归因于ABA生物合成激活、渗透调节能力改善和细胞膜稳定性增强。遗传定位将HTD8界定于第11号染色体0.81 Mb区间内，区别于已报道的分蘖相关基因，表明HTD8是一个尚未克隆的新基因。转录组证据表明多种植物激素通路的联合扰动和碳代谢通量再分配是htd8表型形成的基础。HTD8在调控水稻株型、激素稳态和非生物胁迫适应中发挥重要作用，为高产耐逆水稻分子育种提供了重要遗传材料和理论基础。