《Plants》：Next-Generation Sequencing Reveals the Total Yeast and Mold Species Present in Greenhouse-Grown Cannabis Inflorescences—Implications for Quality Control
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采用下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术测定七种含四氢大麻酚（delta9-tetrahydrocannabinol, THC）基因型大麻（*Cannabis sativa* L.）花序内真菌与酵母菌物种组成（真菌组
采用下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术测定七种含四氢大麻酚（delta9-tetrahydrocannabinol, THC）基因型大麻（*Cannabis sativa* L.）花序内真菌与酵母菌物种组成（真菌组，mycobiome），样品来自常规水培或有机生产条件下的商业温室。基于DNA序列与数据库代表物种的同源性，最多鉴定出26种真菌与酵母菌。真菌组组成随栽培方式、大麻基因型及采后干燥而变异。有机栽培花序中真菌总reads数最高。支撑花序的茎组织含有高达50%的真菌总reads。扫描电镜观察显示茎组织内存在真菌孢子样结构和菌丝。在花序中占真菌总reads >1%的属包括*Alternaria*、*Aspergillus*、*Botrytis*、*Candida*、*Fusarium*、*Penicillium*、*Trichoderma*和*Rhizophagus*。花序采后干燥使真菌总reads降低50–65%，降幅取决于大麻基因型和真菌物种。对分离的腺毛腺体进行NGS分析，检出多种空气传播真菌，包括*Penicillium*、*Fusarium*、*Beauveria*、*Trichoderma*、*Aspergillus*、*Botrytis*、*Alternaria*和*Aureobasidium*。扫描电镜观察到孢子样结构附着于腺毛外表面。产霉菌毒素的*Aspergillus*物种出现罕见，而被认为具有潜在产霉菌毒素能力的*Alternaria*、*Fusarium*和*Penicillium*物种更为常见。12份干燥大麻样品中reads最多的真菌物种为*Penicillium chrysogenum*、*P. citrinum*和*Alternaria* spp.；*Botrytis*和*Fusarium* spp.亦存在于6份样品中。在开花期使用含*Trichoderma*和*Beauveria*的生物防治产品，增加了新鲜花序中这些物种的reads，并部分残留至干燥样品。在花序组织中检测到菌根真菌*Rhizophagus irregularis*。花序内还以极低频率存在若干此前未报道的真菌物种reads，其来源可能为周围环境或大麻栽培所用生长基质。在若干干燥样品中发现人DNA，可能源于采后花序的人工处理。上述结果表明温室栽培大麻花序中某些真菌/酵母属具有多样性和普遍性。
**研究背景与问题提出**
大麻（*Cannabis sativa* L.）因富含delta9-四氢大麻酚（THC）而在加拿大、美国多个地区及其他获得监管批准的司法辖区进行商业化种植，其主要产品为干燥花序（"buds"）。商业生产多在温室或室内种植室进行，高密度种植条件下真菌、细菌、病毒和类病毒等植物病原体的管理成为主要挑战，病原体可直接侵染花序造成"芽腐"（bud rot）的显著损失。*Botrytis*和*Fusarium*等病原体在干燥产品中的残留，引发使用者吸入孢子或霉菌毒素的担忧。因此，供人使用的干燥大麻花芽须检测酵母菌和霉菌总数（total yeast and mold, TYM）、已知人类致病菌、特定霉菌毒素及农药等污染物水平。TYM检测由商业实验室采用琼脂培养基或膜培养法测定可培养物种，以每克干品的菌落形成单位（colony-forming units, cfu）表示；加拿大上限为50,000 cfu/g，美国各州则设有1,000至100,000 cfu/g不等的不同限值。然而，现行检测所反映的可培养TYM能否代表样品中真菌组的完整谱系尚存疑问，这关系到检测能否真正提供产品安全性保证。此前少数研究尝试将大麻组织中的酵母和霉菌鉴定至属或种水平以评估其潜在危害；基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）的分子检测可快速准确评估特定物种，全基因组测序（NGS）则可鉴定样品中包括不可培养者在内的微生物物种，并已用于确定温室大麻营养组织内生真菌和酵母物种，但这些物种在花序组织中的分布尚未明确。因此，研究人员采用鸟枪法克隆结合NGS的策略，解析大麻花序真菌组组成，并考察其来源及随基因型、采后干燥和生产方式（常规或有机）的变化，同时对相应组织进行扫描电镜观察以定位TYM可能存在的部位。
**主要技术方法**
研究人员采集同一温室环境下水培（5个基因型）或有机生产（2个基因型）的温室大麻花序，2024年不同时期取样，每株4–5个花序合并为一份混合样，共24份花序样品（单重复）进行NGS分析，另纳入种子和生长基质样品；样品以新鲜或按商业程序干燥（终含水量约12–14%）状态使用，部分样品在开花期施用含*Trichoderma*和*Beauveria*的生物防治产品。取50–100 mg组织液氮研磨后提取DNA，送Medicinal Genomics公司建库并在Illumina NovaSEQ平台测序，reads比对母本基因型'Jamaican Lion'参考基因组后，未比对上的微生物序列经Kraken和Braken软件进行宏基因组物种注释，并以Krona图可视化。此外，对花序支撑茎横切面和带腺毛的苞片组织进行冷冻扫描电镜观察，并将表面消毒的茎段和干燥花序组织涂布马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar）回收真菌。
**研究结果**
*样品来源*：供试花序及其支撑茎组织（未表面消毒）用于NGS分析，采后按商业程序干燥后同样取样分析，DNA提取用量50 mg。
*下一代测序*：24份花序样品的真菌总reads及物种归属以Krona图呈现。有机生产样品（2份）真菌总reads高于水培样品（5份），但因样本量有限无法作统计学推断；干燥使5个基因型的可检测真菌总reads降低约50–65%；不同基因型真菌总reads存在差异。在全部基因型中频率最高的属为*Alternaria*、*Aspergillus*、*Botrytis*、*Candida*、*Fusarium*、*Penicillium*、*Phycomyces*、*Trichoderma*和*Rhizophagus*；新鲜花序中*Alternaria*和*Fusarium*分别在基因型B和C中占优势，*Trichoderma*次之且存在于全部4个基因型，其后为*Penicillium*和*Rhizophagus*；干燥后各基因型优势属转为*Penicillium*，其次为*Rhizophagus*；新鲜茎样品中以*Penicillium*最普遍，其次为*Aspergillus*和*Rhizophagus*。占真菌总reads >1%的属中，新鲜与干燥花序共鉴定出多达26个物种，其中*Candida*是唯一频率>1%的酵母；种子和生长基质样品中亦确认存在相应物种。频率<1%的次要物种中，新鲜花序物种多样性高于干燥样品；另鉴定出两种地衣（*Endocarpon*和*Letharia*），且人（*Homo sapiens*）DNA仅见于干燥样品而不见于新鲜样品，提示可能源于采后处理或DNA提取过程的污染。
*扫描电镜*：茎横切面可见中央髓部及其周围髓薄壁细胞、木质部管胞和导管分子以及表皮组织；高倍下髓薄壁细胞和导管元件内可见孢子样结构，部分样品中可见与木质部导管相关的菌丝生长。表面消毒茎段涂布培养回收出*Beauveria*、*Trichoderma*、*Botrytis*和*Penicillium*，干燥花序组织涂布回收出*Penicillium*和*Aspergillus*。腺毛头部表面可见孢子样结构，包括小的圆形单细胞孢子、类似白粉病菌*Golovinomyces*的矩形孢子，以及嵌于腺毛树脂分泌物中的类*Penicillium*孢子。腺毛制剂的NGS分析检出多达14个属和种，以*Beauveria*、*Fusarium*和*Penicillium* spp.频率最高。
**讨论与结论**
讨论指出，TYM检测目前反映的是可变且未知的种群，关键未知在于何种真菌或酵母物种构成可培养TYM。本研究中频率最高的属包括*Alternaria*、*Botrytis*、*Fusarium*和*Penicillium*（此前报道为大麻兼性病原），以及具生物防治活性的*Trichoderma*等腐生或有益真菌，提示TYM可源于病原侵染、环境来源的二次定殖或生防真菌施用。茎组织内的孢子样结构和菌丝表明其可能保护真菌并提供内生传播途径，而商业检测的研磨过程会将茎内真菌纳入计数。生长基质和种子中检出若干相同物种，提示基质来源和种传可能。干燥降低多数属的reads，对*Trichoderma*影响大于*Penicillium*和*Rhizophagus*；在3份TYM >50,000 cfu/g（未通过）的干燥样品中，*Penicillium*、*Fusarium*、*Botrytis*或*Beauveria*占真菌总reads的27–81%。本研究未检出与曲霉病风险相关的*Aspergillus*物种，温室合法栽培大麻的*Aspergillus*及霉菌毒素污染风险较低；而*Alternaria*和*Fusarium*在适宜条件下产毒的可能性及温室内的发生频率尚不清楚。*Penicillium*是本研究中出现最频繁的属，以*P. chrysogenum*和*P. citrinum*最常见，其易在琼脂上回收且产抗生素特性可能抑制其他真菌生长，可能是样品TYM检测不合格的主要原因之一，其潜在危害尚待评估。NGS方法仅提供相对丰度而非实际水平，真菌reads约占总真核DNA的0.03–0.5%，且无法判断死细胞与活细胞比例，故不能直接与培养计数比较；次要物种频率极低，对TYM贡献不显著。研究结论为：本研究采用全基因组测序方法鉴定了温室栽培大麻花序中存在的多种真菌和酵母物种；尽管TYM平板计数（可培养物种总和）与NGS鉴定结果（所有可能物种的检测）之间无法直接比较，结果仍显示了花序潜在微生物定殖者的多样性和普遍性，尤其表明*Penicillium* spp.是采前和采后定殖的主要成分，这或许需要进一步评估其直接致病或产霉菌毒素的潜在危害；产毒*Aspergillus*物种在合法温室大麻生产中远不常见；茎相关酵母和霉菌种群对可培养TYM计数的贡献需进一步评估；了解具有潜在危害的特定物种可能比可培养物种总数（其中可包括被认为对人类危害较小的物种）更具信息价值；高酵母和霉菌水平反映的是促进定殖的栽培环境并导致劣质产品，但现行TYM检测方法提供的质量评价是否等同于安全性评价尚存疑问；有必要开展更多研究，通过鉴定最普遍物种并评估其潜在危害，来评价TYM检测在大麻安全与质量控制中的解释意义；本研究中鉴定最普遍的属（*Penicillium*、*Alternaria*、*Fusarium*和*Botrytis*）并未纳入现行大麻检测监管框架下的关注物种。
