《Toxics》：Gestational Pyrethroid Exposure and Placental Health in Wistar Rats: Evaluation of Epigenetic, Developmental, and Oxidative Stress Biomarkers
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了解胎盘毒性（placental toxicity）机制可为阐明生命早期暴露（early-life exposure）如何影响不良妊娠结局（adverse pregnancy outcomes）、胎儿健康（foetal health）及成年期长期疾病风险（lo
了解胎盘毒性（placental toxicity）机制可为阐明生命早期暴露（early-life exposure）如何影响不良妊娠结局（adverse pregnancy outcomes）、胎儿健康（foetal health）及成年期长期疾病风险（long-term disease risk in adulthood）提供重要研究工具。本研究评估了经口孕期暴露于拟除虫菊酯类杀虫剂（pyrethroid insecticide）α-氯氰菊酯（α-cypermethrin，α-cyp）——一种潜在的内分泌干扰物（endocrine disruptor）——在剂量为1、10和19 mg/kg bw/day时对Wistar大鼠胎盘不同参数的影响（每组n = 5；共30只动物）。研究人员采用焦磷酸测序法（pyrosequencing method）评估LINE1重复序列区域内的全基因组DNA甲基化（global DNA methylation），并通过免疫组化（immunohistochemical）和组织病理学（histopathological）分析评估发育参数，以及胎盘重量（placental weight）变化，并通过高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography）和分光光度法（spectrophotometry）评估氧化应激生物标志物（oxidative stress biomarkers）。全基因组DNA甲基化百分比呈剂量依赖性下降，但差异不显著。相反，暴露于10和19 mg α-cyp/kg bw/day后，观察到胎盘滋养层巨细胞（trophoblast giant cells）增殖显著下降。细胞凋亡（apoptosis）、胎盘组织病理学、胎盘重量或所检测的氧化应激参数均未见显著变化。上述发现提示，孕期α-cyp暴露可能通过降低滋养层巨细胞增殖及细微的表观遗传改变影响胎盘发育，而未见明显的组织病理学或氧化改变。尚需进一步研究以确定这些反应背后的分子机制及其对胎盘功能和胎儿发育的潜在意义。
研究背景：拟除虫菊酯类杀虫剂（pyrethroid insecticides）系由除虫菊（Chrysanthemum cinerariaefolium）中提取的天然杀虫成分除虫菊素（pyrethrins）衍生而来，经改造以提高其在阳光下的稳定性和杀虫活性。因杀虫效能高、环境持久性较低且对人和哺乳动物毒性较低，世界卫生组织（WHO）于20世纪80年代末推荐使用溴氰菊酯（deltamethrin）和氯菊酯（permethrin）两种合成拟除虫菊酯，此后其作为高毒、难降解的有机氯和有机磷杀虫剂的替代品使用不断扩大。根据分子结构中是否含有α-氰基，拟除虫菊酯分为I型和II型，I型缺乏α-氰基，一般产生震颤（T）综合征且毒性较低；II型含α-氰基，产生舞蹈手足徐动伴流涎（CS）综合征且毒性较高。氯氰菊酯（cypermethrin）属II型，α-cyp由氯氰菊酯两个活性最强的异构体组成，是最畅销的拟除虫菊酯之一，除农业用途外还用于室内环境及兽医实践。普通人群暴露主要经膳食摄入新鲜和烹调的果蔬，职业暴露主要经皮肤、其次经吸入。拟除虫菊酯代谢和排泄迅速，人口服α-cyp约36%被吸收，大鼠约45%被吸收，广泛分布于全身，以脂肪组织浓度最高，96 h内排泄完毕。拟除虫菊酯对昆虫的毒性约为哺乳动物的2250倍，其通过改变电压敏感性钠通道动力学扰乱昆虫神经系统。除神经系统外，动物和人类研究显示拟除虫菊酯在极低暴露水平下可作为内分泌干扰化学物（endocrine-disrupting chemicals，EDCs）影响雌雄生殖系统，亦可影响免疫和呼吸系统，并可导致氧化应激和表观遗传调控异常。拟除虫菊酯残留已在人母乳、脐带血和胎粪中检出，提示可能存在胎儿暴露；越来越多的证据表明其可穿过胎盘屏障到达胎儿室。胎盘作为母胎界面，是生物监测农药暴露的重要工具。农药作用的重要机制包括内分泌干扰、氧化应激诱导、胎盘形态改变、胎盘线粒体功能受损及细胞增殖与凋亡平衡改变。近年流行病学和实验研究显示表观遗传机制可能参与农药的有害效应，DNA甲基化是研究最多的表观遗传机制，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DMT）在胎盘组织中高表达。胎盘不仅是胎儿健康、生长和发育所必需的重要器官，还可能影响胎儿编程（foetal programming）并诱导基因表达的长期改变，从而导致成年期疾病。研究目的为探讨孕期暴露于α-cyp对Wistar大鼠胎盘的影响，评估LINE-1重复区域全基因组DNA甲基化百分比、增殖与凋亡标志物蛋白表达的免疫组化定量、经典组织病理学改变，以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度（高效液相色谱法）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平及过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）催化活性（分光光度法）。
主要技术方法：研究以IMROH（克罗地亚萨格勒布）近交系Wistar大鼠为对象，3月龄性成熟雌鼠（初始体重约220 g），按1:1与未暴露雄鼠交配，检出阴道涂片精子或阴栓之日定为妊娠第1天（GD1）。孕鼠随机分为对照组和处理组（每组n = 5），于妊娠第6至21天经口灌胃给予α-cyp 1、10和19 mg/kg bw/day（最低剂量为人类可接受日摄入量ADI 0.02 mg/kg bw/day乘以6.2的人-鼠外推校正因子所得的10倍），阴性对照给予水、溶剂对照给予玉米油、阳性对照给予己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）10 μg/kg bw/day。GD21麻醉处死后采集双侧子宫角胎盘并称重；用于氧化应激分析的胎盘冻存于?20 °C，用于表观遗传分析的一半冻存于?80 °C，另一半固定于Sainte Marie液后石蜡包埋、制备4 μm连续切片。关键方法包括：亚硫酸氢盐转化（EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit）后PCR扩增大鼠LINE-1重复区域，以焦磷酸测序法（Pyromark Q24 Advanced系统）测定三个CpG岛的甲基化水平并以C/T比值计算、取三者均值作为全局甲基化（每组6个胎盘样本）；以兔抗磷酸化组蛋白H3（pSer10和pThr11）为M期标志物、兔抗剪切型caspase 3为凋亡标志物行免疫组化（LSAB2 System-HRP、DAB显色、苏木精复染）；苏木精-伊红染色行组织病理学定性立体学分析（11项参数，按无、轻度、中度、重度改变分级为0–3）；以Weibel 42点多功能测试系统（M42）行定量立体学分析，计算组蛋白H3及剪切型caspase 3阳性细胞的数值密度（Nv）；以高效液相色谱-荧光检测法测定MDA，以DCF-DA、单氯二胺（MBCl）探针及试剂盒分光光度法测定ROS、GSH及CAT、SOD、GSH-Px活性（每组5个胎盘，均三重复）。统计采用Kruskal–Wallis检验及Dunn多重比较事后检验（GraphPad Prism 10.3.1）或Bonferroni校正的多重比较（Statistica 14.0.0.15），p < 0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
3.1 大鼠胎盘组织全基因组DNA甲基化：孕期经口暴露α-cyp未显著影响大鼠胎盘组织全基因组DNA甲基化百分比，但随剂量增加甲基化百分比下降，在所有CpG岛及平均值中，最高剂量（19 mg/kg bw/day）组甲基化百分比最低。
3.2 大鼠胎盘的增殖与凋亡活性：以磷酸化组蛋白H3表达评估细胞生长。与阴性对照相比，两个较高剂量（10和19 mg/kg bw/day）组滋养层巨细胞增殖显著降低（分别为p < 0.0001和p < 0.0005），亦显著低于最低剂量1 mg/kg bw/day组（p < 0.0001）；溶剂对照组增殖亦显著低于阴性对照（p < 0.0005）和1 mg/kg bw/day组（p < 0.0001）；10 mg/kg bw/day组显著低于阳性对照（p < 0.0001）。剪切型caspase-3免疫组化结果显示，在所试浓度下α-cyp不诱导凋亡。
3.3 大鼠胎盘组织病理学改变：GD21时，11项参数中4项出现统计学显著的组织病理学改变，阴性对照与阳性对照在4项参数上不同，溶剂对照与阳性对照在3项参数上不同；与阴性对照和溶剂对照相比，阳性对照组的滋养层巨细胞胞质变性、海绵滋养层（spongiotrophoblast）变性（坏死）及基带出血显著增加；与阴性对照相比，阳性对照组迷路带出血显著增加。
3.4 胎盘重量：所有实验组间大鼠胎盘重量未见显著差异。
3.5 生化标志物：三个α-cyp剂量均使胎盘组织MDA浓度降低，但与阴性对照相比无统计学显著性。最高剂量（19 mg/kg bw/day）使ROS水平升高，而两个较低剂量使其降低，变化均不显著；最高剂量组ROS值约为两个较低剂量组的近两倍；阳性对照较溶剂对照ROS水平显著升高（p = 0.0089）。三个α-cyp处理组GSH水平较阴性对照略有升高但无显著性。CAT活性无显著变化，但呈剂量依赖性下降，最高剂量组最低。SOD活性在各α-cyp组与阴性对照间相近，无显著影响。GSH-Px活性无显著影响，最低剂量组升高、两个较高剂量组略降低。几乎所有氧化应激标志物（尤其MDA、ROS和GSH）浓度范围较宽，可能与生物学异质性和方法学因素有关；每组5个胎盘样本来自5只不同母鼠。
讨论与结论：2005年Environmental Working Group报道新生儿脐带中检出数十种化学物，加之已知多种环境化学物可穿过胎盘屏障到达胎儿，近几十年来引起广泛关注。已知拟除虫菊酯可穿过胎盘并对发育中的胎儿产生不良健康后果，可直接或经胎盘间接发生。胎盘组织因富含激素受体而对EDCs尤为敏感，拟除虫菊酯的内分泌干扰特性已被认识，EDCs暴露可抑制胎盘发育和功能。关于拟除虫菊酯介导的胎盘毒性及对胎盘本身影响的研究仍很少，孕期这一关键窗口尤具研究价值。本研究首次探讨孕期经口暴露于II型拟除虫菊酯α-cyp对Wistar大鼠胎盘多种毒性生物标志物的影响。啮齿类与人类胎盘在形态和遗传上具有显著相似性（均为盘状、血绒毛膜型），大鼠胎盘是研究胎盘过程与机制的适宜模型，但结果外推至人类需谨慎。连接环境因素与胎盘发育、功能及妊娠结局的最强机制是胎盘表观基因组变异；DNA甲基化是调控胎盘发育和胎儿生长相关基因的关键机制，人类胎盘全基因组DNA甲基化水平较其他体细胞组织低14–25%且模式保守。LINE1元件为高度重复、广泛散布的逆转座子，在体细胞组织中通常高度甲基化，可作为全基因组DNA甲基化的替代标志物。本研究显示α-cyp使LINE1重复区域全基因组DNA甲基化百分比随剂量下降但不显著；既往关于有机氯农药等持久性有机污染物（POPs）与胎盘甲基化的研究结果不一，且实验动物研究几乎阙如。大鼠胎盘胎儿部分包括迷路带和基带，迷路带因高血流、高增殖活性及增殖期长而是化学毒性的靶点，滋养层细胞增殖活性于GD13达峰并于GD21前逐渐下降。本研究显示阳性对照DES使GD21迷路带出血显著增加，α-cyp未见显著影响；阴性对照组亦见迷路带出血可用妊娠末期胎盘退变解释。基带于GD13增殖达峰、GD15后明显下降并于分娩前退化；滋养层巨细胞为大细胞、多倍体核，参与内分泌活动并作为母胎界面的免疫屏障。本研究多数参数无显著变化可归因于GD21采样时这些细胞正常减少；仅DES组滋养层巨细胞胞质变性显著增加。基带滋养层巨细胞增殖在10和19 mg α-cyp/kg bw/day组显著降低；在无可检测信号情况下，研究者认为所试浓度下α-cyp不诱导程序性细胞死亡。海绵滋养层变性仅DES组显著增加，DES组基带出血亦显著高于阴性对照。糖原细胞囊性变性在α-cyp组呈剂量依赖性增加（与DES组相似）但无显著性。已有研究报告DES及多种拟除虫菊酯（α-cyp、β-氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯）孕期暴露对啮齿类胎盘形态、血管发育及增殖/凋亡的不同影响。胎盘采样时机亦需考虑：仅于GD21采样仅提供胎盘形态的“快照”，不能确定α-cyp是否在GD13–15胎盘生长、分化和细胞增殖活跃期引起组织学改变；因此若干组织学参数无显著改变并不排除更早期发生效应的可能。胎盘重量是评估胎盘损伤对胎儿毒性间接影响的重要标志，本研究α-cyp未影响GD21胎盘重量，与既往α-cyp和氰戊菊酯研究一致，而氟氯氰菊酯可降低大鼠胎盘重量。正常胎盘发育和功能的关键是活性氧/氮物种（ROS/RNS）产生与抗氧化防御系统（SOD、CAT、GSH-Px及GSH）间的平衡，环境因素或外源物暴露可致氧化应激，是胎盘组织损伤和多种妊娠疾病的重要因素。氧化应激被认为是拟除虫菊酯等农药毒性的主要机制之一；拟除虫菊酯代谢途径中的水解和氧化过程可产生活性氧。孕期母体和胎儿氧化过程因耗氧增加及ROS的生理参与而增强；与人类不同，大鼠和小鼠迷路带在妊娠中期胚胎发生基本完成后才发育，可能通过维持更恒定的氧环境保护早期胎儿。MDA是评估脂质过氧化损伤最常用的标志物。本研究显示孕期α-cyp暴露未影响大鼠胎盘自由基产生，最高剂量组ROS升高但不显著，MDA无变化；与部分既往研究（α-cyp 0.3、3、10 mg/kg/day未显著改变小鼠胎盘MDA；α-cyp联合束缚应激或β-氯氰菊酯可致氧化应激和胎盘血管发育异常）结果相似或不同。本研究未观察到SOD、CAT活性、GSH水平或GSH-Px活性的显著变化，可能归因于在该研究条件下α-cyp未增强ROS生成或激活代偿性抗氧化机制。作者亦承认局限性：本研究为评估孕期α-cyp暴露对大鼠表观遗传编程及生殖发育内分泌干扰的更广泛项目的一部分，该项目还包括母体组织（含胎盘）、胎儿体和羊水中α-cyp浓度分析，将有助于理解其经胎儿直接或经胎盘间接的作用方式；样本量较小（每组n = 5–6，基于既往研究和3Rs原则确定）可能限制统计效能，对高变异的氧化应激标志物尤为相关，故无统计学差异不应解释为治疗无效应；统计分析未单独建模母鼠层面变异；不能完全排除溶剂载体的潜在贡献，故α-cyp处理组观察到的效应不能完全归因于α-cyp。尽管如此，滋养层巨细胞增殖降低及全基因组DNA甲基化的剂量依赖趋势值得进一步研究其分子机制和功能意义，未来应研究这些胎盘改变是否与胎盘功能改变、不良妊娠结局或子代发育改变相关，并在更接近人类暴露的水平上验证其生物学相关性。
结论（译）：由于胎盘健康对胎儿的健康发育至关重要，任何由外源物暴露诱导的损伤均可能威胁胎儿发育并导致成年期疾病。迄今为止，文献中尚无如此全面的研究，考察生命早期农药暴露这一环境因素对胎盘发育多种参数（包括表观遗传过程）的影响。本研究首次探讨大鼠孕期暴露于拟除虫菊酯杀虫剂α-cyp后，胎盘LINE1重复区域内DNA甲基化可能引起的表观遗传扰动，并同时评估发育参数、胎盘重量变化及氧化应激生物标志物。所得结果表明，孕期暴露于潜在内分泌干扰化学物α-cyp改变了大鼠胎盘滋养层巨细胞增殖，并与LINE-1 DNA甲基化的剂量相关模式有关。这些发现为拟除虫菊酯杀虫剂α-cyp可能影响胎盘发育的潜在作用方式提供了重要见解，其可能涉及表观遗传修饰。作为亲脂性化合物，拟除虫菊酯农药在脂肪组织中蓄积并可穿过胎盘。研究拟除虫菊酯胎盘转运的报告显示α-cyp经胎盘向胎儿的转运有限，经口给药后母体和胎盘组织中的浓度显著高于胎儿体和羊水。尽管有限的胎盘转运可减少胎儿的直接暴露，但α-cyp对胎盘发育和功能的潜在影响仍具相关性，因为胎盘可能直接暴露于该化合物，且胎盘改变可间接影响胎儿发育。本研究结果与人类健康的相关性还应结合实际暴露水平加以考虑：按物种校正比较，本研究所用最低剂量（1 mg/kg bw/day）约为人类ADI的十倍，因此在将结果外推至典型人类职业和环境暴露情景时需谨慎。需要采用更接近人类暴露水平的研究以阐明α-cyp诱导胎盘毒性的机制并评估其对母婴健康的潜在意义。阐明这些机制对于理解导致不良妊娠结局和胎儿发育受损的通路至关重要。此外，在发育编程的关键窗口期环境暴露于EDCs可能产生持久的健康后果，凸显了研究其对胎盘功能影响的重要性。
