HNO3预处理氧化石墨烯（GO）修饰笔芯石墨电极用于PSA检测：面向一次性无标记电化学免疫传感器的概念验证

《Chemosensors》：An HNO3-Pretreated, Graphene Oxide-Modified Pencil Graphite Electrode for PSA Detection: Toward a Disposable Label-Free Electrochemical Immunosensor

　　

前列腺癌是一种肿瘤性疾病，通常在晚期出现前保持无症状。在迄今获批的前列腺癌诊断技术中，前列腺特异性抗原（PSA）筛查是其早期检测最成熟的方法。目前，集中化临床实验室使用昂贵、耗时、多步免疫分析检测血清PSA，这些方法高度依赖实验室技术人员和高度复杂的设备。为解决该问题，研究人员开发了一种概念验证的一次性无标记电化学生物传感器，采用单次抗原孵育步骤快速检测PSA-α₁-抗胰凝乳蛋白酶复合物（PSA-ACT）和游离PSA（fPSA）。该免疫传感器基于HNO₃预处理笔芯石墨电极（PGEs），并采用氧化石墨烯（GO）修饰。通过循环伏安法（CV）测量[Fe(CN)₆]^3?/4?氧化还原探针信号确定抗原浓度；抗原分子存在降低了PGE表面的阳极电流响应。对PSA-ACT观察到1–1000 ng/mL的对数线性校准响应和估计检出限（LOD）2.48 ng/mL，表明tPSA生物传感器的检测范围为2.48–1000 ng/mL。fPSA免疫传感器在0.1–1000 ng/mL显示对数线性校准响应；然而，未确定低于最低实验评估校准品（0.1 ng/mL）的分析LOD。对生物传感器性能、选择性、重复性和短期储存稳定性的分析，以及使用真实人样本与商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒的初步比较，为这些平台进一步开发和优化用于即时检验（POC）PSA检测提供了早期证据。

研究背景：前列腺癌是男性常见恶性肿瘤，通常直至晚期才出现症状，早期检测对控制疾病和改善治疗结局具有重要意义。PSA筛查是前列腺癌早期检测中最成熟的方法。血清中PSA主要分子形式为PSA-α₁-抗胰凝乳蛋白酶复合物（PSA-ACT）和游离PSA（fPSA），二者合计为总PSA（tPSA），其中PSA-ACT约占70–90%。临床常检测tPSA和fPSA并计算fPSA/tPSA比值；tPSA低于4 ng/mL常提示前列腺正常，4–10 ng/mL灰区需进一步诊断评估，高于10 ng/mL常与前列腺癌相关，fPSA/tPSA低于15%提示前列腺癌可能性较高。目前集中化临床实验室多采用昂贵、耗时、多步免疫分析检测血清PSA，依赖技术人员和高端设备；全自动免疫分析仪虽提高通量，但仍存在批间变异，且仪器昂贵笨重，不适合即时检验（POC）和低资源地区。电化学生物传感器具有低成本、快速、灵敏、易小型化等优势；传统玻碳电极（GCE）、Au电极和Pt电极较贵且难以一次性使用，而笔芯石墨电极（PGE）成本低、来源丰富，适合一次性平台，但其导电性不如GCE或Au电极。HNO₃氧化预处理可增加PGE表面含氧官能团、亲水性和粗糙度，氧化石墨烯（GO）及其氨基功能化产物GO–NH₂具有含氧官能团和高比表面积，有利于固定捕获探针。基于此，研究人员开发了基于HNO₃预处理PGE和GO–NH₂修饰的一次性无标记电化学免疫传感器，用于PSA-ACT和fPSA检测。研究采用戊二醛交联固定抗PSA或抗fPSA单克隆抗体，牛血清白蛋白（BSA）封闭，单次抗原孵育，并以CV在[Fe(CN)₆]^3?/4?探针中检测。结果显示，tPSA平台对PSA-ACT在1–1000 ng/mL呈对数线性响应，估计LOD为2.48 ng/mL，检测范围2.48–1000 ng/mL；fPSA平台在0.1–1000 ng/mL呈对数线性响应，但低于0.1 ng/mL的分析LOD未确定；选择性、重复性和28天短期储存稳定性获得初步证据，并与商业ELISA在人样本中进行了初步比较。该研究的重要意义在于证明将廉价一次性PGE、已有表面修饰策略和无标记电化学检测整合用于平行测量临床相关PSA分子形式的可行性，同时明确其当前分析局限。

关键技术方法：通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）表征GO–NH₂及电极表面；采用HNO₃预处理PGE，GO–NH₂修饰，戊二醛交联固定抗体，BSA封闭，单次抗原孵育；以CV在[Fe(CN)₆]^3?/4?探针中完成电极表征和抗原定量；建立半对数校准模型，按CLSI EP17和Armbruster–Pry方法估计LOD；用BSA和促甲状腺激素（TSH）评估选择性，用5支电极评估重复性，用28天储存评估短期稳定性；去标识人血清和加标尿样来自Padtan Gostar Isar Co.（PGI, Tehran, Iran），用于与商业ELISA的初步比较。

研究结果：3.1 GO–NH₂的结构表征：通过FTIR观察到GO的羧基O–H、C=O、芳香环C=C、羧基和羟基O–H弯曲、C–O等特征，GO–NH₂出现酰胺相关C=O、C–N和N–H特征，支持GO氨基功能化；作者同时指出部分谱带可能重叠，解释为定性证据。3.2 工作电极的结构与电化学表征：FTIR显示HNO₃预处理PGE含氧官能团增加；SEM显示预处理后表面更粗糙并形成片状结构，利于GO–NH₂沉积；CV显示HNO₃预处理PGE的I_a,max显著高于裸PGE，GO–NH₂单独修饰裸PGE未增强甚至略降低，GO–NH₂/HNO₃预处理PGE的I_a,max最高；抗体固定降低I_a,max，BSA封闭增加，抗原结合后降低。3.3 实验条件优化：通过不同抗体固定时间和抗原孵育时间的CV响应，tPSA和fPSA生物传感器抗体固定30 min达平台；tPSA抗原孵育30 min达平台，fPSA在30 min与45 min间无显著差异，后续fPSA实验采用45 min，但优化数据提示30 min可能提供相当响应。3.4 生物传感器的分析性能：tPSA平台用0.01–1000 ng/mL PSA-ACT评估，0.01和0.1 ng/mL与无抗原响应不可区分而被排除，1–1000 ng/mL对数线性R²=0.9215，估计LOD为2.48 ng/mL，检测范围2.48–1000 ng/mL；fPSA平台在0.1–1000 ng/mL对数线性R²=0.9724；信号域LOD对应约7.42 pg/mL，但低于最低实验评估校准品，属不支持外推，未确定低于0.1 ng/mL的分析LOD；残差分析和lack-of-fit检验支持半对数校准模型。3.5 免疫传感器的选择性、重复性和短期储存稳定性：BSA和TSH样本响应显著低于PSA样本，支持对上述干扰物的选择性；5支tPSA和5支fPSA电极的RSD分别为2.68%和1.72%；28天4 °C储存期间平均I_a,max变化分别为2.09%和2.56%，但个别时间点存在变异且重复数有限。3.6 与商业ELISA试剂盒的初步比较：用3份未知PSA血清和加标40、150、250 ng/mL PSA-ACT的尿样比较，除尿样U-2的PSA-ACT水平外，生物传感器与商业ELISA测量量级大体相近；样本量小，未进行Bland–Altman或Passing–Bablok一致性分析，属初步方法比较。

讨论部分总结：该研究的科学贡献不在于提出全新的电极材料或表面化学，而在于将HNO₃预处理PGE、GO氨基功能化、戊二醛交联抗体和无标记CV检测等已有组件整合为可平行测量PSA-ACT和fPSA的一次性平台。讨论指出，I_a,max在正向切换电位附近测量且未扣基线，可能同时包含法拉第和非法拉第电流，因此不能将信号变化单独归因于扩散阻碍或电荷转移电阻；CV虽便于表征和定量，但未显示其分析灵敏度优于脉冲伏安技术。局限性包括：未进行电化学阻抗谱（EIS）和扫描速率分析，未独立量化电荷转移电阻、扩散控制行为或电活性面积；FTIR和SEM为定性解释，未定量元素和结构组成；选择性仅评估BSA和TSH，未直接评估PSA分子形式间或与结构相关激肽释放酶的交叉反应；tPSA平台未单独用fPSA测试，未证明对fPSA和PSA-ACT的等摩尔响应，未评估fPSA/tPSA比值及4、10 ng/mL临床阈值附近的判别；真实样本少，未系统评估基质效应，尿样结果仅属初步回收评估；重复性未跨独立制备批次、不同制备日或不同铅笔芯批次，稳定性仅评估单一浓度；戊二醛席夫碱连接未还原，长期稳定性需考虑水解；当前依赖台式恒电位仪，尚非完整POC设备。未来需开展EIS、CV扫描速率、X射线光电子能谱、拉曼光谱和能量色散X射线光谱 mapping 等定量表征，评估制备相关污染，扩大亚型和干扰测试，进行配对基线归一化、基质匹配校准和大队列临床验证，并整合便携恒电位仪、与自动临床免疫分析系统比较及多路复用。Li等、Vural等、Kirlangi?等、Sadeghi等和Soares等的前期工作被用于比较；相较之下，本研究强调低复杂度、无标记和一次性PGE平台的整合可行性。

研究结论翻译：在本工作中，研究人员开发了基于GO–NH₂修饰、HNO₃预处理PGE的概念验证无标记电化学免疫传感器，用于PSA-ACT和fPSA检测。该研究证明将廉价、一次性PGE与已建立的电极表面修饰和无标记电化学策略结合以测量PSA的可行性。更广泛地，研究结果表明这些已建立策略可整合为较低复杂度的一次性平台，用于平行测量临床相关PSA分子形式，并识别了推进进一步开发所需的分析和转化改进。该平台在评估的校准范围内显示浓度依赖性响应，并进一步评估了选择性、条件内重复性、短期信号保持以及在人样本中的初步性能。当前系统需要受控孵育、洗涤和干燥，以及台式电化学仪器来检测和定量抗原，因此应被视为实验室概念验证而非完整POC设备。总体而言，研究人员的发现支持继续开发该平台，朝适合未来POC应用的简化、便携格式发展。未来研究应优先开展扩展的定量结构、元素和电化学表征；用tPSA替代PSA-ACT用于tPSA平台的校准和性能评估；评估两个平台的PSA亚型选择性；将平台与便携恒电位仪整合；并使用大型临床样本队列将两个平台与常用自动临床免疫分析系统进行比较。