IFN-γ与促炎细胞因子诱导星形胶质细胞抗原提呈程序并支持抗原依赖性CD4+ T细胞再刺激

《Cell Reports》：IFN-γ and proinflammatory cytokines induce astrocyte programs that support antigen-dependent CD4+ T cell restimulation

　　

星形胶质细胞对中枢神经系统（CNS）抗原提呈的贡献仍不明确。本研究表明，干扰素γ（IFN-γ，即唯一的II型干扰素）与促炎细胞因子共同诱导星形胶质细胞表达介导CD4⁺ T细胞趋化与抗原提呈的组分。对注射细菌模拟物小鼠的星形胶质细胞富集单细胞测序数据再分析显示，外周免疫激发后24 h出现一个转录上独特的、IFN应答性星形胶质细胞群体，富集抗原提呈相关基因。在体内，II型主要组织相容性复合体（MHC-II⁺）GFAP⁺星形胶质细胞在多种小鼠神经炎症模型及人类神经疾病组织中定位于脑表面。体外实验中，经IFN-γ与促炎细胞因子刺激的纯化星形胶质细胞表达MHC-II、共刺激分子及淋巴细胞招募趋化因子，并在共培养中支持既往活化的CD4⁺ T细胞发生快速的抗原依赖性扩增。人诱导多能干细胞（iPSC）来源的CNS培养显示，炎症细胞因子刺激后人星形胶质细胞可同等诱导抗原提呈机器。上述发现界定了一种细胞因子诱导的星形胶质细胞状态，其在神经免疫界面表达抗原提呈机器并可支持局部CD4⁺ T细胞应答。

研究背景：星形胶质细胞长期被视为维持CNS稳态的支持性细胞，近年逐渐被认识为神经炎症中的动态免疫效应细胞。病理条件下星形胶质细胞变为反应性，获得转录异质性身份与多样表型。既往研究已报道星形胶质细胞在阿尔茨海默病（AD）、感染、CNS损伤、多发性硬化（MS）、帕金森病等情境下存在MHC-II相关基因转录，体外IFN-γ处理后可产生MHC-II蛋白，且可提呈神经元抗原并与致病性T细胞相互作用驱动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）病理。然而，诱导更完整抗原提呈程序所需的细胞因子条件、以及该程序能否功能性支持抗原特异性CD4⁺ T细胞应答，仍不完全明确；仅表达抗原提呈组分不足以描述星形胶质细胞加工与提呈抗原的功能能力。CNS曾长期被视为免疫豁免区，但多种胶质与浸润免疫细胞群参与神经免疫过程；CD4⁺ T细胞可外渗入CNS并局部克隆扩增，其机制尚不清楚。星形胶质细胞广泛分布于CNS，胞体衬附于软膜胶质界（GLS）接触富含免疫细胞的脑膜腔，终足衬附血管周隙，处于与外渗外周免疫细胞首次接触的部位。为此，研究人员采用无免疫细胞的纯星形胶质细胞培养体系，界定足以诱导该程序关键组分的细胞因子组合，检验受刺激星形胶质细胞能否在纯共培养体系中支持既往活化CD4⁺ T细胞的抗原依赖性应答，并考察小鼠与人组织中MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞在炎症情境下的分布。研究使用卵清蛋白特异性T细胞受体II（OT-II）与2D2 T细胞受体（TCR）转基因系统，以模型抗原及CNS相关抗原检验上述相互作用。研究结论为：炎症细胞因子组合，尤其是IFN-γ联合促炎信号，诱导星形胶质细胞获得更广泛的抗原提呈相关表型，并在体外支持既往活化CD4⁺ T细胞的抗原依赖性再刺激/扩增；同时MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞在小鼠与人类多种炎症情境下出现于CNS边界，处于战略性神经免疫界面。该研究将星形胶质细胞置于炎症CNS中固有免疫与适应性免疫的关键交汇点，界定了可诱导的星形胶质细胞免疫互作程序，并为今后体内验证其功能重要性提供框架；但体内观察为描述性，未证实星形胶质细胞抗原提呈的原位必要性。

关键技术方法：研究采用星形胶质细胞富集单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据再分析（小鼠数据源自GSE148612，为人iPSC来源CNS培养数据存入GSE311173）；采用改良自Clayton等的无血清纯化小鼠原代皮质星形胶质细胞培养体系并以批量RNA测序验证纯度；采用磁珠分选（MACS）纯化CD4⁺CD25^- T细胞、CFSE标记及流式细胞术检测增殖；采用免疫荧光与共聚焦成像进行细胞与组织定量；采用多重Luminex细胞因子阵列分析分泌组；采用人外周血单核细胞（PBMC）重编程iPSC并分化为多细胞CNS培养（6名供体），行10× Flex高多重探针单细胞转录组测序。样本队列来源：人iPSC供体PBMC来自约翰霍普金斯大学多发性硬化精准医学卓越中心（6名供体，5女1男，年龄35–52岁）；人MS组织（4例MS、4例无症状对照）与AD组织（6例AD、5例无症状对照）见表S2；小鼠模型包括LPS与IFN-β腹腔注射、MOG35–55诱导EAE及K18-hACE2小鼠SARS-CoV-2鼻内感染。

研究结果：IRRAs表达抗原提呈相关转录特征——再分析LPS腹腔注射后24 h小鼠皮质scRNA-seq，IFN刺激基因模块评分特异定位于第8簇，并与MHC-II抗原提呈基因模块重叠；这些细胞缺乏小胶质细胞、少突胶质细胞谱系、血管细胞与神经元标志基因，确证为星形胶质细胞。体内LPS或IFN-β注射后24 h，Aldh1l1eGFP⁺MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞见于皮质边界，而盐水组未见；定量显示MHC-II⁺GFAP⁺CD45^-细胞显著增加，且局限于皮质边界，与CD45⁺免疫细胞及软膜细胞不同。IFN-γ与促炎细胞因子诱导致抗原提呈机器产生——纯化星形胶质细胞中，IFN-γ或TICIγ（TNF、IL-1α、C1q联合IFN-γ）处理显著诱导MHC-II蛋白，IFN-β诱导较弱，TIC单独无明显诱导；TIC足以诱导CD86与CD80，TICIγ则同时诱生MHC-II与共刺激分子。载入OVA 323–339肽后，细胞表面MHC-II可被特异性可溶性TCR识别；MHC-II与晚期内体标志RAB7a共定位而不与早期内体标志EEA1共定位。多重细胞因子阵列显示CXCL10、CCL5、CCL2在TICIγ与TIC处理后强烈诱导，IFN-γ单独则不然，免疫染色证实TICIγ后CXCL10产生。综上，IFN-γ足以诱导MHC-II，而促炎TIC信号为参与共刺激与趋化因子等辅助程序所必需。细胞因子刺激的星形胶质细胞在体外支持抗原依赖性CD4⁺ T细胞扩增——OT-II系统中，TICIγ+OVA预处理星形胶质细胞与CFSE标记的既往活化CD4⁺CD25^- T细胞共培养后，成像见CD3⁺CFSE⁺ T细胞沿星形胶质细胞突起明显积聚与扩增，而缺乏细胞因子预处理、缺乏OVA或使用野生型多克隆T细胞时均未见此效应；流式显示TICIγ+OVA条件下CFSE低（CFSElo）增殖群显著增加。以2D2 TCRMOG转基因T细胞重复实验，在TICIγ+MOG35–55肽及TICIγ+完整MOG蛋白条件下均见选择性扩增，后者提示星形胶质细胞具备摄取并加工完整蛋白抗原的能力。未经预活化的初始T细胞共培养时各条件细胞死亡比例高（16.5%–60.9%），但TICIγ+OVA组CD3⁺ T细胞比例仍较高（71.4%对27.9%–36.3%），提示在现有培养条件下星形胶质细胞更有效地支持既往活化的效应样T细胞而非初始T细胞。将活化T细胞-星形胶质细胞条件培养基（TACM）加入大鼠混合皮质培养，PDGFRa⁺细胞增加，PDGFRa⁺Ki-67⁺双阳性细胞呈非显著性增加，总DAPI⁺与Ki-67⁺细胞数未增加；68种细胞因子谱分析显示活化TACM组成明显改变，呈异质性T细胞应答，涉及B细胞活化（BAFF）、IFN-γ/Th1应答偏移以及IL-13、IL-10、sFas/颗粒酶B等可能对应的Th2、Treg与细胞毒性T应答。人iPSC来源星形胶质细胞在炎症细胞因子刺激下上调抗原提呈相关机器——6名供体来源iPSC分化的多细胞CNS培养经溶剂、TNF或IFN-γ处理（共18份样本），10× Flex单细胞转录组（18,129个基因探针）显示细胞类型界限清晰；因靶向探针集不含多态性MHC基因，实验未直接检测人MHC-II转录，而是通过CIITA、CD74、抗原加工基因和T细胞互作基因支持更广泛抗原提呈程序的诱导。基线仅小胶质细胞有明显CIITA表达，IFN-γ刺激后星形胶质细胞（及OPC）中显著上调；CXCL10与CD74亦升高，CXCL10对TNF反应更强而CD74对IFN-γ反应更强；PSMB8、PSMB9、TAP1、TAP2、B2M及ICAM1、BTN3A1、BTN2A1、LGALS9在TNF与IFN-γ处理后均升高。伪批量差异表达与基因本体（GO）分析显示TNF条件上调细胞因子转录、IFN-γ条件上调IFN刺激基因，前5条上调通路涉及对病原侵袭或细胞因子释放的应答；星形胶质细胞亦表达淋巴细胞趋化因子基因（CXCL10、CCL2、CCL5），与小鼠结果相似；小胶质细胞表达免疫调节细胞因子基因，TNF可降低多种此类基因表达；OPC仅见增殖标志（MKI-67、TOP2A）中度升高而无谱系定向基因改变。这些数据支持人星形胶质细胞可诱导免疫互作程序的保守性，并强调细胞环境对完整表达的重要性。MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞存在于多种神经炎症情境——MOG35–55诱导EAE小鼠于第13–15天达峰值评分3、体重下降约17%，峰值时皮质边界MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞显著增加且邻近CD3⁺ T细胞，MOG对照少见。SARS-CoV-2 WA-1株2,000 PFU鼻内接种K18-hACE2小鼠5天后，GLS区见MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞并与病毒核衣壳染色共定位，盐水组未见；IFN-γ阻断3天后沿实质表面未见此类细胞而皮质病毒核衣壳负荷升高。人严重原发进展型MS（PPMS）前额叶皮质边界可见MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞，见于细胞增多区（可能对应活动性病灶）边界及大血管附近，数量较非MS脑显著增加；严重AD患者前额叶皮质此类细胞总数及其距实质表面距离亦显著增加。非神经系统老年对照组织中也存在少量此类细胞，提示年龄与累积炎症暴露可能影响基线丰度，而慢性炎症疾病状态与数量增加及分布更广相关。总体而言，这些体内数据为描述性，确立此类细胞的存在与定位，而非证明其在原位抗原提呈中的功能贡献大小。

讨论部分总结：该研究在纯星形胶质细胞培养体系中证明IFN-γ联合促炎TIC信号上调MHC-II、共刺激分子及淋巴细胞招募趋化因子等抗原提呈相关机器，受刺激星形胶质细胞支持既往活化CD4⁺ T细胞的抗原依赖性再刺激；单细胞转录组再分析与组织染色在小鼠和人类多种炎症情境下识别出CNS边界的MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞，较既往仅显示MHC-II相关分子表达的工作显著拓展。讨论围绕若干问题展开：CNS边界MHC-II⁺星形胶质细胞如何在自身免疫中可能支持自身反应性CD4⁺ T细胞局部再刺激、在感染中可能参与免疫监视，均仍属需体内直接检验的假说；活化的星形胶质细胞-T细胞条件培养基促进OPC增殖标志，但其分子基础与体内相关性未明，应视为假说生成性发现；何种CD4⁺ T细胞状态被优先支持尚属开放问题，细胞因子谱提示异质性输出而非单一亚型选择性富集，未来需界定抗原剂量、共刺激平衡、炎症细胞因子与星形胶质细胞状态对Th1、Th2、Th17或调节性程序的影响；该表型在啮齿类与人系统中常于24–48 h内快速上调，其为短暂反应状态抑或持久功能重编程仍未知。研究局限包括：共培养中MACS分选后残留约4% CD3^-细胞理论上可能含B细胞等专职抗原提呈细胞；缺乏MHC-II阻断或星形胶质细胞特异性H2-Ab1缺失，无法确证应答归因于星形胶质细胞MHC-II（Aldh1l1Cre H2-Ab1fl/fl尝试致胚胎致死）；未设仅含T细胞及相同细胞因子与抗原的对照，未直接检验炎症环境能否诱导TCR非依赖性细胞因子产生；使用既往活化而非初始CD4⁺ T细胞；OVA与MOG仅为原理验证；MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞相对稀疏且与其他抗原提呈细胞共存。综上，研究未证明星形胶质细胞等同于专职抗原提呈细胞、能有效致敏初始T细胞或在体内为神经炎症T细胞应答所必需。

研究结论翻译：本研究显示，炎症细胞因子组合，尤其是IFN-γ联合促炎信号，诱导星形胶质细胞获得更广泛的抗原提呈相关表型，并在体外支持既往活化CD4⁺ T细胞的抗原依赖性再刺激/扩增。同时，MHC-II⁺GFAP⁺星形胶质细胞在小鼠与人类的多种炎症情境下出现于CNS边界，使其处于战略性神经免疫界面。这些体内观察为描述性，并未确立星形胶质细胞抗原提呈在原位的特异性必要性。因此，研究人员将本研究视为界定了一种可诱导的星形胶质细胞免疫互作程序，并为今后在神经炎症中检验其功能重要性提供了框架。