云南文山蚊媒新型双节段RNA病毒——文山蚊病毒的鉴定与分子特征研究

《Sensors》：Identification and Characterization of Wenshan Mosquito Virus, a Putative Novel Bisegmented RNA Virus from Mosquitoes in Yunnan Province, China

　　

蚊媒相关病毒对全球公共卫生构成重大威胁，中国西南部云南省是虫媒病毒出现的关键热点区域。本研究于2023年夏季从文山地区采集了隶属于3个物种（三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus、中华按蚊Anopheles sinensis和致倦库蚊Culex quinquefasciatus）的2612只雌性蚊虫。病毒宏转录组学分析鉴定出一种新型双节段正义单链RNA病毒，命名为文山蚊病毒（Wenshan mosquito virus，WSMV）。其基因组全长4741个核苷酸，包含两个节段：节段1（3127 nt）编码一个S39家族肽酶和一个RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），而节段2（1614 nt）编码一个衣壳蛋白和一个假定蛋白。成对核苷酸同一性分析显示，节段1和节段2与湖北蚊病毒2型（Hubei mosquito virus 2，HMV-2）的同一性分别为87.62%和86.96%。鉴于该谱系尚未建立物种界定标准，WSMV被描述为HMV-2相关群内的推定新型病毒。基于共有分类群的系统发育分析将WSMV在两条节段中均稳定地与HMV-2聚类。WSMV在三带喙库蚊和中华按蚊的蚊池中检出（最低感染率MIR分别为2.08‰和1.54‰），但在检测数量有限的致倦库蚊蚊池中未检出；因此WSMV的宿主范围仍有待全面界定。本研究扩展了对云南边境地区蚊媒病毒多样性的认识，并为未来研究提供了分子基础。

论文解读：云南文山地区新型双节段RNA病毒——文山蚊病毒的鉴定与分子特征研究

一、研究背景与研究意义

蚊媒相关病毒的传播依赖于特定的蚊虫媒介，其自然传播循环涉及病毒、蚊媒和脊椎动物宿主之间的复杂相互作用，传播动态受媒介分布、环境条件和宿主易感性等多重因素调控。近年来，全球变暖、城市化加速和人口流动性增强显著改变了蚊虫孳生栖息地，进一步扩大了蚊媒病毒传播的地理范围，新发和再发传染病对全球公共卫生构成严重威胁。

云南省位于中国西南部，其独特的低纬度高原地理和多样地形造就了温暖湿润、垂直分带显著的气候，为蚊虫孳生、繁殖和进化提供了极为有利的条件，使云南成为中国蚊虫物种多样性最丰富的地区。云南西南部与缅甸、老挝和越南接壤，缺乏天然屏障加剧了外来虫媒病毒跨境输入的风险，使该区域成为区域性虫媒病毒传播的关键枢纽。历史监测表明，当地蚊虫和发热患者中已检出多个病毒科的不同蚊媒相关病毒，流行格局复杂，表现为跨境输入频繁、再发病毒持续循环和新病毒不断涌现。然而，尽管病毒生态格局复杂，对当地蚊虫携带病毒多样性的认识仍然有限，亟需对新分离毒株进行分子特征鉴定以明确其分类地位并扩展该区域蚊媒病毒多样性知识。本研究正是在这一背景下，对文山地区采集的蚊虫进行了病毒宏转录组学分析，发现并系统表征了一种新型双节段RNA病毒。

二、研究内容与主要结论

研究人员在云南省文山地区2023年6月至8月期间，基于当地畜牧养殖分布设置了8个采样点，使用紫外光诱蚊灯采集雌性蚊虫。经形态学和分子生物学鉴定，共获得2612只雌性蚊虫，隶属于两个属三个物种：三带喙库蚊（1437只，占55.01%）、中华按蚊（649只，占24.85%）和致倦库蚊（526只，占20.14%）。按采集日期、采样点和形态型进行分池（每池≤50只），共获得53个蚊池。通过病毒宏转录组测序和从头组装，鉴定出一种与湖北蚊病毒2型（HMV-2）高度相似的新型双节段正义单链RNA病毒，命名为文山蚊病毒（WSMV）。其基因组全长4741 nt：节段1（3127 nt）编码S39家族肽酶（ORF1，628 aa）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp，ORF2，351 aa）；节段2（1614 nt）编码衣壳蛋白S结构域蛋白（ORF3，220 aa）和功能未知的假定蛋白（ORF4，233 aa）。成对序列同一性分析显示，WSMV节段1和节段2与HMV-2的核苷酸同一性分别为87.62%和86.96%，表明HMV-2是WSMV在序列水平上最接近的已知病毒。基于共有分类群的系统发育分析解决了因分类群取样差异导致的拓扑不一致问题，WSMV在两条节段中均与HMV-2稳定聚类。RT-qPCR筛查显示，4个蚊池检测阳性，均来自三带喙库蚊和中华按蚊，两个节段在所有阳性蚊池中均被共检出。三带喙库蚊和中华按蚊的最低感染率（MIR）分别为2.08‰和1.54‰，两者无统计学显著差异（Fisher精确检验，p=1.000）。病毒分离尝试在Vero、BHK-21和C6/36三种细胞系中均未观察到典型细胞病变效应，未获得具有感染性的活病毒，表明在所试实验条件下未能证明WSMV的产毒性复制。AlphaFold 3结构预测揭示了各ORF产物的三维结构特征：ORF1的Peptidase_S39结构域折叠为紧凑核心构象；ORF2的RdRp核心结构域具有高度保守的折叠模式，催化残基位于240–242位；ORF3的衣壳蛋白S结构域呈现典型的β-桶拓扑结构；ORF4未检测到已知保守结构域但可折叠为稳定空间构象。这些结构特征与HMV-2高度一致，进一步支持两者的密切同源关系。

三、主要技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：基于COI基因的分子鉴定确认蚊虫物种；病毒宏转录组测序（RNA-seq）结合宿主序列去除和从头组装进行病毒序列发现；RT-qPCR双节段特异性引物探针筛查验证病毒核酸存在；最大似然法（ML）系统发育分析构建节段特异性进化树；AlphaFold 3蛋白质三维结构预测与功能域注释；以及Vero、BHK-21和C6/36细胞系病毒分离尝试。样本来源于云南省文山地区8个采样点2023年夏季采集的蚊虫标本。

四、研究结果

3.1 蚊虫采集与核酸检测结果：共采集2612只雌性蚊虫，三带喙库蚊为优势物种。宏转录组分析获得约8000条比对到WSMV基因组的clean reads，平均覆盖深度约150×，覆盖率超过95%。RT-qPCR筛查53个蚊池，4个阳性，均来自三带喙库蚊（3个）和中华按蚊（1个），两个节段在所有阳性蚊池中均被共检出。三带喙库蚊MIR为2.08‰（95% CI: 0.43–6.09‰），中华按蚊MIR为1.54‰（95% CI: 0.04–8.58‰），总体MIR为1.53‰（95% CI: 0.42–3.92‰）。

3.2 基因组结构分析结果：WSMV基因组由两个正义单链RNA节段组成，总长4741 nt。节段1（3127 nt）含ORF1（编码S39家族肽酶）和ORF2（编码RdRp）；节段2（1614 nt）含ORF3（编码衣壳蛋白S结构域蛋白）和ORF4（编码假定蛋白）。BLAST同源性搜索显示两个节段均与HMV-2具有最高核苷酸同一性（87.62%和86.96%），同时与库蚊luteo样病毒和Peninsere病毒也表现出较高同一性。

3.3 系统发育分析结果：基于节段1的系统发育树显示WSMV与Peninsere病毒聚为一支（99% bootstrap支持），该支进一步与库蚊luteo样病毒和Riboviria sp.所在支形成姐妹群（99%支持）。基于节段2的系统发育树显示WSMV与HMV-2关系最密切，与库蚊luteo样病毒共同形成独立分支（70%支持）。采用共有分类群重建后，拓扑不一致得到解决，WSMV在两条节段中均与HMV-2稳定聚类。基于RdRp氨基酸序列的系统发育分析结果与核苷酸树一致。

3.4 蛋白质结构预测结果：AlphaFold 3预测显示ORF1的Peptidase_S39结构域（181–305位残基）折叠为紧凑核心构象（结构域pLDDT 94.38，结构域内平均PAE 2.20 ?）；ORF2的RdRp核心结构域（55–303位残基）具有高度保守折叠模式（结构域pLDDT 93.89，平均PAE 3.29 ?），催化残基位于240–242位；ORF3的Viral_coat结构域（89–220位残基）呈现典型β-桶拓扑（结构域pLDDT 93.74，平均PAE 3.39 ?）；ORF4无已知保守结构域但可折叠为稳定构象（平均pLDDT 55.61）。各结构域特征与HMV-2高度一致。

3.5 病毒分离结果：在Vero、BHK-21和C6/36三种细胞系中均未观察到典型细胞病变效应，所有分离尝试均未获得感染性活病毒。原代培养初期虽可检测到WSMV RNA信号（Ct=30.5±0.5），但14天后Ct值升至35.6±1.4超过阳性阈值，后续传代中信号完全消失，表明在所试条件下未能证明WSMV的产毒性复制。

五、讨论总结与结论

讨论部分指出，三带喙库蚊作为文山地区优势蚊种，与当地水稻种植和畜牧养殖密切相关。WSMV的MIR值与云南地区已知蚊媒病毒（如乙型脑炎病毒JEV）的感染率相当。WSMV RNA仅在库蚊和按蚊中检出而未在致倦库蚊中检出，但由于致倦库蚊样本量有限（11池526只），该检测模式不应被解读为不同蚊种间媒介易感性差异的证据，可能反映样本量不足或采样偏倚。生态位分化可能影响病毒与媒介的接触机会。WSMV与HMV-2的核苷酸同一性（87.62%和86.96%）略低于中国境内HMV-2分离株之间的同一性范围（90.4–99.5%），提示WSMV可能代表HMV-2的一个地理分化株或一个密切相关但不同的物种。由于该病毒谱系尚未被ICTV正式分类且缺乏物种界定标准，WSMV被描述为HMV-2相关群内的推定新型病毒。系统发育分析中观察到的拓扑不一致主要源于分类群取样不均衡，而非重组或重配事件。病毒分离失败可能反映检测到的RNA为残余基因组物质或该病毒在所提供的细胞培养条件下无法有效复制，需通过负链RNA检测、更多蚊源细胞系筛选和实验性媒介感染研究加以区分。研究局限性包括单季节采样、混合分池检测、缺乏Sanger测序独立验证以及末端序列未确定。

研究结论：本研究首次报道了在云南省文山地区蚊虫中鉴定的一种新型双节段RNA病毒WSMV，并基于现有序列对其基因组结构和分子特征进行了系统表征。病毒基因组包含两个正义单链RNA节段：节段1编码S39家族肽酶和RdRp，节段2编码衣壳蛋白和假定蛋白。系统发育分析表明WSMV与HMV-2关系最为密切；然而，由于该谱系尚未建立物种界定标准，WSMV被描述为HMV-2相关群内的推定新型病毒。该病毒在三带喙库蚊和中华按蚊两种蚊种中检出，提示其在自然界中的生态分布可能比目前记录的更为广泛；但鉴于样本量有限，在致倦库蚊中未检出的结果应谨慎解读，真实宿主范围有待进一步研究。WSMV RNA在三带喙库蚊和中华按蚊中检出，但这些蚊种是否支持病毒复制或传播仍有待确定。本研究结果扩展了对云南边境地区蚊媒病毒多样性的认识，并为未来研究该病毒的生态动态、宿主范围、进化历史及潜在公共卫生意义提供了必要的分子基础。