基于TurboID邻近标记技术的大豆广谱抗病毒蛋白SRC7互作组筛选与功能解析

《Biology》：TurboID Screening and Functional Analysis of the Interactome of the Broad-Spectrum Antiviral Protein Soybean Resistance Cluster 7 (SRC7)

　　

植物病毒病在全球作物生产中造成严重的产量损失。SRC7是一种新型大豆TIR-NBS-BSP型抗病（R）蛋白，对包括大豆花叶病毒（SMV）、烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和李痘病毒（PPV）在内的多种病毒具有广谱抗病毒免疫能力。其TIR-NBS结构域（SRC7TN）介导完整的抗病毒抗性，使其成为筛选免疫相关邻近候选蛋白的理想诱饵。本研究采用基于TurboID的邻近标记（PL）技术，在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中绘制SRC7TN邻近候选蛋白图谱。研究人员鉴定出262个高置信度邻近候选蛋白，主要富集于植物免疫信号、氧化还原调控、蛋白质修饰和核相关通路。其中，21个候选蛋白经功能鉴定，揭示多个宿主因子参与SRC7依赖性抗病毒免疫。通过双分子荧光互补（BiFC）实验确认了11个蛋白互作，并对两个核苷/核苷酸水解酶家族蛋白MZN14.5和RIHA进行了进一步的互作结构域分析。综上，本研究构建了高置信度的SRC7TN邻近互作网络，凸显了SRC7介导的广谱抗病毒免疫中的关键宿主因子，同时验证了TurboID在异源植物系统中筛选NLR邻近候选蛋白的实用性，为R蛋白调控的植物抗病毒防御提供了新见解。

一、研究背景与科学问题

植物病毒病在全球范围内造成主要作物的严重产量损失。植物进化出多层免疫系统以抵御病原攻击，其中RNA干扰（RNAi）被视为通用抗病毒机制，但多数植物病毒编码沉默抑制子靶向RNAi通路组分加以抑制。除RNAi外，植物还拥有病原相关分子模式触发的免疫（PTI）和效应子触发的免疫（ETI）。ETI通常由宿主编码的抗病（R）蛋白触发，大多数R蛋白属于含有中央核苷酸结合位点（NBS）结构域和C端富亮氨酸重复（LRR）结构域的NBS-LRR（NLR）蛋白家族，其N端分别具有TIR或CC结构域，相应称为TNL或CNL蛋白。

R蛋白介导的信号建立需要众多宿主伙伴蛋白的参与。传统遗传分析虽鉴定出大量R基因信号所需宿主基因，但遗传筛选未必能识别R蛋白的直接互作蛋白，因为此类方法发现的基因往往在下游信号中发挥作用而非与R蛋白直接物理互作。酵母双杂交（Y2H）系统虽被广泛使用，但存在无法完全重现植物细胞环境中内源蛋白互作、高丰度持家基因过度表达、结果冗余及依赖cDNA文库质量等固有局限。为此，研究人员开发了植物体内筛选方法，其中酶催化邻近标记（PL）技术近年来成为克服上述局限的有力工具。TurboID是一种经大肠杆菌BirA定向进化改造的工程化生物素连接酶，在植物生长的较低温度下仍具高酶活性，已被成功应用于植物NLR蛋白互作组研究。

此前研究人员已鉴定出一种新型大豆TIR-NBS-BSP型R基因SRC7，具有广谱病毒抗性和非经典BSP结构域等多项此前未报道的特征。SRC7对多种不同科属的病毒具有强抗性，其TIR结构域对启动免疫信号既必要又充分，NBS结构域则以顺式依赖性方式增强信号活性并介导必需的核寡聚化。本氏烟具备支持SRC7介导免疫级联的完整免疫通路，且大豆难以进行高效瞬时表达和高通量功能筛选，而本氏烟已被确立为研究NLR介导免疫、蛋白互作组和PL的通用异源模式系统，因此研究人员在此系统中开展TurboID筛选。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：以SRC7^TN融合TurboID和HA标签构建诱饵载体，并以核定位信号（NLS）-GFP-TurboID-HA作为核定位阴性对照，以空载体（EV）作为空骨架对照；通过农杆菌介导的瞬时表达在本氏烟中表达重组蛋白，外源补充生物素进行体内邻近标记；利用链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白，经胰蛋白酶酶解后进行TMT同位素标记和二维液相色谱-串联质谱（2D LC-MS/MS）定量蛋白质组学分析；采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）和瞬时过表达进行功能筛选，以GFP标记的TMV和SMV感染性克隆评估抗病毒活性；通过双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）验证蛋白互作；利用AlphaFold3（AF3）进行结构预测分析结合界面。

三、主要研究结果

3.1 利用TurboID邻近标记在本氏烟中鉴定SRC7^TN邻近候选蛋白

研究人员构建了pCAMBIA1300-SRC7^TN-TurboID-HA（TTH）和pCAMBIA1300-NLS-GFP-TurboID-HA（NGTH）载体并瞬时表达于本氏烟叶片。Western blot确认两种融合蛋白以预期分子量正常表达，共聚焦显微镜确认NGTH的核积累。融合TurboID-HA未损害SRC7^TN对TMV感染的抗病毒活性，表明重组蛋白保留生物学功能。实验设置EV、NGTH和TTH三组，每组三个生物学重复。经TMT标记和2D LC-MS/MS分析，共鉴定4644个蛋白，严格过滤后获得3573个蛋白。主成分分析显示三组间清晰分离且组内重复性良好。以FDR校正q值<0.05且TTH相对NGTH和EV均>1.5倍富集为标准，TTH vs. EV鉴定1165个差异富集蛋白，TTH vs. NGTH鉴定291个，韦恩分析获得262个重叠蛋白，定义为高置信度SRC7^TN邻近候选蛋白。GO富集分析显示这些蛋白富集于植物免疫、蛋白质修饰和核调控等功能类别。

3.2 通过过表达分析SRC7^TN邻近候选蛋白功能

从262个候选蛋白中精选21个关键蛋白进行功能验证，其中4个蛋白（RIN4、PRPX1、PRPX2和DRB4）主要基于已有文献报道的免疫功能优先选择。因两个旁系同源基因对（PAL2/PAL4和PRPX1/PRPX2）侧翼序列高度相似无法单独扩增，最终成功克隆19个基因的全长cDNA。瞬时过表达结合TMV-GFP和SMV-GFP接种实验显示：8个基因（NbPER52、NbPEX19、NbMIJ24.8、NbMZN14.5、NbF23M19.10、NbTBC5A、NbRIHA和NbDNAJ）显著增强SRC7介导的对SMV和TMV的抗性；3个基因（NbDOX1、NbRBOHC和NbACO）表现出TMV特异性抗病毒活性；NbDRB4显著增强SRC7对SMV的抗性，而NbPALY和NbPAL4显著削弱该抗性；其余5个基因（NbF6N7.6、NbF6F22.26、NbVAD1、NbRIN4和NbPRPX1）对病毒增殖影响微弱或可忽略。核心抗病毒基因的表达水平与其抑制病毒移动的效果紧密相关。

3.3 通过TRV-based VIGS分析SRC7^TN邻近候选蛋白功能

研究人员采用TRV-based VIGS系统在过表达SRC7的本氏烟（OxSRC7Nb）中系统性沉默候选基因。对照组表型与此前发现一致：TRV-Vector处理的OxSRC7Nb植株对TMV-GFP和SMV-GFP均表现强抗性，而TRV-SRC7沉默完全消除宿主抗性。VIGS分析显示，TMV处理中沉默17个基因显著损害SRC7介导的抗性，SMV处理中沉默16个基因显著增强病毒积累。NbPALY和NbACO的沉默特异性降低对TMV的抗性，NbDRB4的沉默特异性损害对SMV的抗性。RT-qPCR验证所有21个靶基因均被有效下调，确认增强的病毒易感性源于免疫相关因子下调而非VIGS脱靶效应。

3.4 通过BiFC验证11个SRC7^TN互作蛋白

从TurboID筛选和功能鉴定中选取11个候选基因（DOX1、RBOHC、PER52、PEX19、MZN14.5、F23M19.10、TBC5A、RIHA、VAD1、ACO和DNAJ）进行BiFC验证。空载体阴性对照无荧光信号，而SRC7^TN与11个候选蛋白共表达均观察到黄色荧光，多数信号沿细胞轮廓分布。其中DOX1、RBOHC、PER52、PEX19、F23M19.10、TBC5A、ACO和DNAJ与SRC7^TN的互作信号较强。值得注意的是，实验组细胞轮廓在明场下模糊或不均匀透亮，36小时出现局部点状透亮坏死，48小时细胞结构进一步破坏，黄色荧光在透亮区域边缘检测到，提示SRC7^TN与其互作蛋白的物理互作可能与免疫相关细胞损伤有关。

3.5 两个核苷/核苷酸水解酶MZN14.5和RIHA的分析

研究人员聚焦于MZN14.5和RIHA两个核苷/核苷酸水解酶家族蛋白。Y2H实验显示MZN14.5与SRC7^TIR互作，RIHA与SRC7^TN互作。BiFC实验进一步确认MZN14.5或RIHA与SRC7^TIR共表达产生沿细胞轮廓分布的荧光，与SRC7^NBS共表达仅产生不规则荧光，两种方法结果基本一致。抗病毒实验使用因TIR结构域αA1基序第20位G20R突变而丧失抗病毒活性的SRC7突变体M39作为对照，结果显示MZN14.5/RIHA与SRC7^TIR共表达未能显著降低病毒荧光强度，即二者不能恢复SRC7^TIR受损的抗病毒活性。AlphaFold3结构预测显示MZN14.5稳定结合SRC7^TN同源四聚体，RIHA与SRC7^TN同源四聚体和单体均稳定互作，提示二者可能通过靶向SRC7^TN同源四聚体的功能界面调控其组装或构象稳定性，而非直接替代NBS结构域功能。

四、讨论与结论

讨论部分指出，异源表达系统是NLR互作组鉴定中被广泛接受且遗传上合理的方法，TurboID筛选依赖体内邻近标记效率而非天然突变背景，功能验证提供了可靠的植物体内遗传证据。研究人员利用SRC7^TN结构域的功能自主性规避全长SRC7的异源表达挑战和非特异性标记，通过直接融合降低嵌合蛋白分子量，提高瞬时表达效率。优化瞬时表达时长至24-48小时并补充6小时生物素孵育，减少蛋白积累不足和过表达背景标记。多对照策略符合降低假发现率的标准。

与N蛋白互作组数据集比较发现22个共同候选基因，其中蛋白磷酸酶2C（PP2C）在两个独立数据集中均表现显著富集，表明不同NLR传感器利用保守调控节点增强植物免疫。多个候选蛋白参与过氧化物酶介导的氧化还原反应、活性氧（ROS）调控、液泡蛋白分选调控、水杨酸（SA）生物合成、Rab GTPase激活蛋白家族、R基因介导无毒识别、核蛋白转运、RNA沉默抗病毒防御、核苷水解酶、植物细胞死亡及蛋白折叠等过程。

研究结论为：本研究成功运用TurboID介导的邻近标记在本氏烟中建立了SRC7^TN高置信度邻近候选蛋白数据集，鉴定出262个可能参与SRC7触发抗病毒免疫的候选宿主蛋白。通过系统过表达和TRV-based VIGS功能筛选，结合BiFC验证，确认了多个此前未报道的SRC7^TN邻近调控蛋白通过氧化还原稳态、蛋白转运、SA信号和应激响应蛋白折叠正向调控植物广谱抗病毒抗性。部分候选基因表现出针对TMV和SMV的病毒特异性调控效应，揭示NLR介导抗病毒防御的复杂多层调控网络。SRC7^TN结构域作为核心信号枢纽，通过动态蛋白-蛋白互作整合核质免疫响应。该研究拓展了对非典型TIR-NBS-BSP NLR在抗病毒免疫中功能机制的理解，为植物免疫通路分子解析提供了宝贵候选基因资源，优化的TurboID筛选策略为探索植物系统中弱和瞬时NLR蛋白互作提供了可靠技术参考，为未来通过分子育种改良作物抗病毒抗性奠定基础。