《Biology》：Integrated Transcriptomic and Proteomic Analyses Reveal Molecular and Cellular Responses to INHA Manipulation in Primary Yak Sertoli Cells
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## 三、摘要翻译
INHA编码抑制素A（inhibin A）与抑制素B（inhibin B）的α亚基，参与雄性生殖内分泌调控；然而，其在牦牛支持细胞（Sertoli cells）中的细胞功能仍知之甚少。本研究以3月龄供体来源的原代牦牛支持细胞为材料，构建I
## 三、摘要翻译
INHA编码抑制素A（inhibin A）与抑制素B（inhibin B）的α亚基，参与雄性生殖内分泌调控；然而，其在牦牛支持细胞（Sertoli cells）中的细胞功能仍知之甚少。本研究以3月龄供体来源的原代牦牛支持细胞为材料，构建INHA过表达与敲低模型，随后开展RNA测序（RNA-Seq）、directDIA定量蛋白质组学、转录组-蛋白质组整合分析及功能实验。基于供体感知、假发现率（FDR）控制的分析显示，过表达后鉴定到949个差异表达基因（DEGs）和1388个差异丰度蛋白（DAPs），敲低后鉴定到28个DEGs和54个DAPs。两种操作在各自实验条件下产生了非等效的分子响应。功能富集分析突出显示了细胞因子相关信号、DNA复制与细胞周期调控、能量代谢以及细胞-基质相关响应。TNF信号在转录组和蛋白质组两个水平均显著富集，而NF-κB信号仅在转录组水平显著富集。整合分析鉴定出98个在INHA过表达后mRNA与蛋白水平均发生改变的分子，其中96个变化方向一致。CCL2、CCL5、IL1RL1、LIF、CTSC、HK2、FN1和ITGA11被优先列为代表性INHA响应候选分子，定量逆转录PCR（qRT-PCR）支持了部分转录水平变化。流式细胞术显示，INHA过表达伴随凋亡增加和活细胞比例降低，而敲低则呈现相反模式。β-微管蛋白（β-Tubulin）免疫荧光显示微管染色模式存在定性差异。上述结果刻画了与INHA扰动相关的分子与细胞响应，并为牦牛支持细胞的后续研究优先列出了候选通路与分子。
## 四、论文解读
**研究背景与立题依据**
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原及周边高海拔地区的重要畜种，适应低氧、低温和营养受限环境。雄性繁殖性能关系到牦牛种群的维持与改良，受睾丸发育、精液品质和内分泌功能影响，而牦牛睾丸体细胞的分子调控研究相对其他家畜仍较薄弱。支持细胞是生精上皮的关键体细胞，承担血-睾屏障形成、生殖细胞营养与代谢支持、旁分泌因子分泌、局部免疫环境调节及细胞间连接重塑等功能。研究人员前期通过全转录组与全长转录组测序分析了不同发育阶段牦牛睾丸组织的基因表达谱，并结合支持细胞功能信息，将INHA确定为候选基因。抑制素A和B属转化生长因子β（TGF-β）超家族异二聚体糖蛋白，INHA编码二者共有的α亚基，与INHBA编码的βA亚基或INHBB编码的βB亚基结合而成；雄性中抑制素B主要由支持细胞产生，负反馈调节垂体促卵泡激素（FSH）分泌。由于mRNA丰度不能完全反映蛋白丰度，单一组学难以全面刻画细胞响应，故有必要整合转录组与蛋白质组，系统解析INHA扰动对牦牛支持细胞的影响。
**研究设计与主要结论**
研究人员分离培养3月龄牦牛原代支持细胞，构建INHA过表达与敲低模型，开展RNA-Seq、directDIA定量蛋白质组学、整合分析及功能实验，并以qRT-PCR进行靶向验证，以CCK-8、Annexin V-FITC/PI流式细胞术和β-微管蛋白免疫荧光评估细胞表型。结果显示，INHA过表达与敲低引发的分子响应并不对称：过表达后差异分子数量远多于敲低，富集于细胞因子信号、DNA复制与细胞周期、能量代谢及细胞-基质相关过程；TNF信号在两个组学水平均显著富集，NF-κB信号仅在转录组水平显著富集；整合分析获得96个mRNA与蛋白变化一致的分子，并优先列出CCL2、CCL5、IL1RL1、LIF、CTSC、HK2、FN1和ITGA11等候选；过表达伴随凋亡升高、活细胞比例下降，敲低则相反，且微管染色模式存在定性差异。该研究刻画了INHA扰动相关分子与细胞响应，为后续功能研究提供了候选通路与分子基础。
**主要关键技术方法**
研究以甘肃甘南合作市6头3月龄健康牦牛（常规商业屠宰、非为本研究专门屠宰）左侧睾丸为样本来源，各供体细胞独立培养并作为独立生物学重复。关键技术包括：原代支持细胞分离培养与分阶段富集（差速贴壁、低渗处理、差速胰酶消化），以GATA4与波形蛋白（vimentin）免疫荧光鉴定；INHA过表达质粒与siRNA转染构建扰动模型（siRNA经筛选后仅用si-INHA-1062），qRT-PCR与Western blotting验证；RNA-Seq结合供体校正的负二项模型差异分析及GO/KEGG富集与GSEA；基于timsTOF Pro 2的directDIA定量蛋白质组学及供体配对检验；转录组-蛋白质组整合分析；以及CCK-8、Annexin V-FITC/PI流式凋亡检测与β-微管蛋白免疫荧光等表型实验。
**研究结果**
3.1 INHA过表达与敲低模型的建立：培养细胞呈典型梭形或不规则形态并具多突起，GATA4主要定位于核、vimentin呈胞质丝状分布，结合分阶段富集支持细胞为支持细胞富集培养物；qRT-PCR显示过表达组INHA mRNA显著升高（组均值比688.18倍，p < 0.01），敲低组显著降低（p < 0.01）；Western blotting显示INHA α亚基丰度过表达组升高1.85倍（p = 0.00126）、敲低组降低（p = 0.0281），证实模型建立成功。
3.2 转录组分析揭示INHA扰动的广泛分子响应：主成分分析显示处理组与对照组明显分离；以FDR < 0.05且|log2FC| > 1为标准，过表达组鉴定949个DEGs（351上调、598下调），敲低组仅28个（10上调、18下调）；层次聚类显示组间表达模式分明，表明INHA表达改变伴随转录谱改变。
3.3 功能富集与GSEA揭示相关生物学过程与信号通路：过表达组DEGs在三个GO域均显著富集，涉及核小体、染色质、细胞周期、血管生成调控及染色质结构组分、DNA结合等；敲低组仅昼夜温度稳态一个BP条目达q < 0.05。KEGG分析中过表达组有16条通路显著富集，包括细胞因子-细胞因子受体互作、TNF信号、IL-17信号和NF-κB信号，敲低组无显著通路。GSEA显示过表达后DNA复制、细胞因子-细胞因子受体互作及VEGF产生正调控正向富集；敲低后视黄醇代谢与类固醇生物合成显著负向富集。
3.4 基于DIA的定量蛋白质组学：共鉴定94,011个前体、85,470个肽段、7345个蛋白组和7493个蛋白；主成分分析显示各组分离；以BH校正FDR < 0.05且FC > 1.2或< 1/1.2为标准，过表达组获1388个DAPs（830上调、558下调），敲低组54个（21上调、33下调），表明INHA扰动伴随蛋白丰度谱改变。
3.5 蛋白质组功能富集与GSEA：过表达组富集于NADH脱氢酶复合体、呼吸链复合体I、氧化还原酶复合体及线粒体呼吸链组装、电子传递等，KEGG显著富集于氧化磷酸化、产热、NOD样受体信号和坏死性凋亡；敲低组富集于核孔篮、核孔、核 periphery等结构条目，KEGG仅DNA复制、核质运输和细胞周期显著。GSEA显示过表达后细胞因子-细胞因子受体互作与TNF信号正向富集、氧化磷酸化负向富集；敲低后磷脂酰肌醇信号系统正向富集，DNA复制与细胞周期负向富集。
3.6 转录组-蛋白质组整合分析：过表达后98个分子在两个水平均达差异标准，其中96个变化一致、2个不一致；敲低后无分子同时满足两个组学差异标准。7187对匹配分子的log2FC呈弱正相关（Pearson r = 0.238），敲低后7094对接近零（r = 0.038）。CCL5、CCL2、IGFBP3、IL1RL1、LIF、CTSC、HK2在两个水平均上调，ATP1A2、MYH11、ITGA11、FN1均下调。跨组学比较显示"response to cytokine"仅在蛋白质组显著，TNF信号通路在两个组学水平均显著富集，NF-κB信号与细胞因子-细胞因子受体互作仅在转录组显著。
3.7 靶向qRT-PCR验证：过表达显著上调IGFBP3、HK2、SMC2、MKI67并下调ITGA11与GSR；敲低显著降低IGFBP3、HK2、MKI67、GSR并升高ITGA11，SMC2无显著差异；ITGA11呈互为相反的响应模式，qRT-PCR方向总体与RNA-Seq一致。
3.8 CCK-8、凋亡与微管组织：四组均可见胞质β-微管蛋白阳性丝状结构，敲低组部分区域结构更交错，过表达组与对照组局部分布和走向存在差异；单一混合细胞制备中，CCK-8参考归一化信号随时间升高，过表达组各时间点均值低于对照、敲低组高于对照（仅描述性分析）；流式细胞术显示过表达组凋亡比例升高18.99个百分点（p = 1.78 × 10
?6）、活细胞比例降低18.04个百分点（p = 0.000102），敲低组凋亡比例降低7.10个百分点（p = 0.0103）、活细胞比例升高7.59个百分点（p = 0.0332）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，INHA扰动改变牦牛支持细胞的分子与功能状态，但过表达与敲低的响应并非对称互逆，可能与扰动幅度、非线性细胞响应及不同扰动方法和阴性对照有关，DEG与DAP计数反映各自分析而非可直接比较的生物学效应量；INHA mRNA大幅升高而蛋白仅升高1.85倍，提示转录与蛋白水平变化幅度不同，部分细胞因子、代谢与凋亡变化可能部分反映表达相关细胞应激。INHA与细胞存活及细胞周期相关分子程序相关，但CCK-8信号无法区分活细胞数量与代谢活性，MKI67、SMC2及DNA复制相关变化应理解为细胞周期调控相关分子响应而非增殖的直接证据。细胞因子信号是突出的INHA响应特征，支持细胞是睾丸免疫微环境的重要调节者，TNF-α可激活支持细胞NF-κB并调控GDNF表达，但富集本身不能确立通路激活或与凋亡的因果关系。代谢与结构方面，过表达后氧化磷酸化负向富集而HK2上调，提示线粒体能量代谢与葡萄糖利用相关程序改变；FN1与ITGA11一致下调及微管染色定性差异提示细胞-基质与细胞骨架相关响应。整合分析优先列出候选分子，但作者亦指出研究限于3月龄牦牛体外未成熟支持细胞模型、过表达水平与生理表达的关系未确定、缺乏表达匹配的无关蛋白对照、敲低仅用单一siRNA且无拯救实验、CCK-8仅基于单一混合制备的技术重复等局限，成熟抑制素产生与分泌及通路激活仍需靶向功能实验证实。
结论（译文）：研究人员利用3月龄牦牛原代支持细胞的INHA过表达与敲低模型，通过RNA-Seq、directDIA定量蛋白质组学及转录组-蛋白质组整合分析刻画了相关分子与细胞响应。分子变化涉及细胞因子信号、DNA复制、细胞周期相关分子程序、能量代谢及细胞-基质相关分子；其中TNF信号通路在转录组与蛋白质组水平均显著富集，NF-κB信号通路仅在转录组水平显著富集。整合分析进一步鉴定出一组变化一致的mRNA-蛋白对，包括CCL2、CCL5、IL1RL1、LIF、CTSC、HK2、FN1和ITGA11，可作为未来功能研究的候选分子；部分RNA-Seq表达模式亦获qRT-PCR支持。细胞水平上，流式细胞术显示INHA过表达伴随凋亡增加与活细胞比例下降，敲低则呈相反模式；β-微管蛋白免疫荧光亦揭示INHA扰动后微管染色模式的定性差异。综上，上述发现表明INHA表达改变与细胞因子及代谢相关分子响应、细胞存活变化和微管组织定性差异相关联，为后续研究INHA在牦牛支持细胞生物学中的作用及其与更广泛抑制素相关调控系统的关系提供了基础。
