《Agronomy》：Comparative and Evolutionary Analysis of Single-Copy Genes in Brassica napus Identifies BnaNRA1 as a Contributor to Nutrient-Responsive Lateral Root Development
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单拷贝基因（single-copy genes）是植物基因组的重要组成部分，但其在多倍体作物中的进化起源与生物学功能仍认识不足。本研究旨在阐明异源四倍体甘蓝型油菜（Brassica napus）中单拷贝基因的进化起源，并鉴定参与根系发育的养分响应型单拷贝基因。
单拷贝基因（single-copy genes）是植物基因组的重要组成部分，但其在多倍体作物中的进化起源与生物学功能仍认识不足。本研究旨在阐明异源四倍体甘蓝型油菜（Brassica napus）中单拷贝基因的进化起源，并鉴定参与根系发育的养分响应型单拷贝基因。研究人员在16个代表性植物物种中系统鉴定了单拷贝基因，并研究了其在异源四倍体甘蓝型油菜中的进化与潜在功能。在16个物种中共鉴定到167,219个单拷贝基因，其中甘蓝型油菜品种中双11（ZS11）含5106个。与白菜（B. rapa）和甘蓝（B. oleracea）的比较共线性分析将204个具有明确亲本关系且锚定于染色体的基因划分为38个遗传型（inherited）单拷贝基因和166个推断的丢失衍生型（loss-derived）单拷贝基因，表明多倍化后重复基因丢失是甘蓝型油菜单拷贝状态重建的重要途径。整合启动子与表达分析鉴定出65个根系及养分响应候选基因。其中，BnaA09G0594900ZS被命名为BnaNRA1，受低氮和低磷处理诱导，编码主要定位于细胞核的蛋白。三个独立的bnanra1编辑株系在养分充足条件下未表现出一致的根系表型，但在缺氮和缺磷条件下侧根形成减少，其中缺磷条件下效应尤为一致。综上，这些发现表明多倍化后重复基因丢失促进了甘蓝型油菜单拷贝状态的重建，并鉴定出BnaNRA1是一个在养分限制下参与侧根发育的养分响应型单拷贝基因。
研究背景方面，基因重复是植物进化创新的重要遗传物质来源，重复基因可经全基因组重复（WGD）或串联、片段、转座等小尺度重复事件产生，随后发生功能保守、亚功能化、新功能化、假基因化或完全丢失。基因现存的拷贝数是重复、保留、功能分化和基因丢失共同作用的结果。单拷贝基因被操作性地定义为基因组中仅存在一个可检测拷贝的基因，其单拷贝状态并不必然意味着从未发生重复，部分基因可能在重复事件后经重复拷贝丢失而恢复为单拷贝。此前对20种被子植物的比较分析鉴定出在多次重复事件后独立恢复为单拷贝状态的一类基因家族，提示额外拷贝对某些基因可能具有选择性不利；随后对29个被子植物基因组的调查揭示了单拷贝基因在丰度、功能组成、表达特征和进化速率上的显著种间变异。然而，以往研究多集中于被子植物间的广泛比较或重复基因保留与丢失的一般模式，单拷贝基因库如何在主要植物谱系间变化、以及异源多倍化后单拷贝状态如何被继承或二次重建，仍缺乏充分刻画。经典禹氏三角（U's triangle）包含三个二倍体种白菜（AA）、黑芥（BB）、甘蓝（CC）及三个衍生的异源四倍体种芥菜型油菜（AABB）、甘蓝型油菜（AACC）和埃塞俄比亚芥（BBCC），为研究异源多倍化后单拷贝基因进化提供了适宜体系。二倍体芸薹属基因组自身即为中多倍体，源于芸薹族特异的全基因组三倍化及随后的广泛染色体重排和基因丢失，后续杂交与染色体加倍又引入了另一套同源基因拷贝。甘蓝型油菜为较近期形成的异源四倍体，其A、C亚基因组分别源自与白菜和甘蓝相关的祖先；ZS11具有解析良好的A、C亚基因组结构，且所有功能实验均在ZS11遗传背景下开展，故被选为本研究的参考基因组。除进化起源外，单拷贝基因的生物学功能与调控特征亦有待研究：缺乏近缘旁系同源基因可能限制遗传冗余，但并不必然意味着组成型表达或仅为管家功能。矿质养分有效性是影响植物发育尤其是根系构型的主要环境因素之一，硝酸盐通过ANR1、NRT1.1等组分调控侧根发育，磷有效性亦改变主根伸长、侧根形成和根系空间分布。甘蓝型油菜根系构型可塑性对养分获取十分重要，但单拷贝基因是否参与油菜养分依赖的根系重塑尚不清楚。为此，研究人员在16个代表性植物物种中系统鉴定并比较单拷贝基因，考察其在禹氏三角六个种中的丰度及亲本单拷贝基因在三个异源四倍体中的保留模式；利用ZS11、白菜和甘蓝间的共线性关系，将甘蓝型油菜单拷贝基因划分为遗传型（IGs）与丢失衍生型（LGs），以评估亲本继承与多倍化后重复丢失的相对贡献；随后分析启动子顺式元件、潜在转录因子结合位点、miRNA–靶标关系及组织和养分响应表达谱；最后选取养分响应型单拷贝基因BnaA09G0594900ZS（命名为BnaNRA1，Nutrient-Responsive Root Architecture 1），利用CRISPR/Cas9编辑株系进行功能鉴定。
关键技术方法方面，研究人员从Phytozome v13（云杉自TreeGenes）获取16个代表性物种的基因组、注释及蛋白序列，以最长转录本为代表，用DIAMOND进行种内all-versus-all BLASTP（E值设为10），保留每个查询蛋白得分最高的两个命中，当自身命中与次优命中的bitscore比值大于3且次优命中E值大于0时判定为单拷贝蛋白，并对禹氏三角六个种采用相同标准；用WoLF PSORT进行亚细胞定位预测，OrthoFinder鉴定直系同源基因组，MEGA11构建邻接法系统发育树，eggNOG-mapper与clusterProfiler进行GO注释与富集；用TBtools中的MCScanX-superfast进行ZS11与白菜、甘蓝的共线性分析以划分IGs与LGs；用PlantCARE、PlantRegMap和psRNATarget预测顺式元件、转录因子结合位点与miRNA–靶标关系；ZS11组织表达数据取自BnIR数据库，低氮、低磷、低钾条件下叶片与根系转录组由研究人员实验室先前生成（处理1、3、5、7、12 d，每条件三个生物学重复，Illumina HiSeq 4000测序，DESeq2鉴定差异表达基因）；以半冬性品种ZS11为野生型，使用实验室先前创制的三个独立CRISPR/Cas9编辑株系bnanra1-1（原株系1271）、bnanra1-2（1270）和bnanra1-3（1269），在固体全营养、低磷、缺磷或缺氮Hoagland培养基上竖直培养，7 d后统计侧根数与主根长；qRT-PCR以BnaC02G0037200ZS（BnaACTIN7）为内参；以35S::BnaNRA1-GFP在表达核定位红色荧光标记的转基因本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达进行亚细胞定位；采用单因素方差分析（ANOVA）与Tukey多重比较检验。
研究结果方面，第一，16个代表性植物物种单拷贝基因的全基因组鉴定与进化特征分析。研究人员分析覆盖绿藻、苔藓、石松、裸子植物、单子叶和双子叶植物的16个物种，发现单拷贝基因数目从大豆的5225个到挪威云杉的18,389个不等，占注释基因比例从大豆的9.32%到Volvox carteri的80.40%，两种绿藻比例较高（70.35%和80.40%），多个被子植物比例较低；除两种藻类外，单拷贝基因编码蛋白普遍短于多拷贝基因；对排除缺失起始甲硫氨酸或短于50个氨基酸后的161,516条序列进行亚细胞定位预测，单拷贝蛋白主要定位于细胞核和叶绿体，其次为细胞质。由此表明单拷贝基因丰度、蛋白长度分布和预测亚细胞定位存在显著种间变异。第二，禹氏三角物种单拷贝基因的鉴定、保留模式与功能富集。三个二倍体种白菜、黑芥和甘蓝分别鉴定到5270、8510和6105个单拷贝基因，占注释基因的13.01%、14.22%和17.25%；三个异源四倍体种芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥和甘蓝型油菜分别鉴定到4138、5904和5106个，占5.20%、6.08%和5.06%，异源四倍体单拷贝基因比例一致低于其二倍体祖先；亲本单拷贝基因保留率显示A基因组来源基因在甘蓝型油菜和芥菜型油菜中分别为13.95%和12.95%，B基因组来源基因在芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中分别为18.83%和20.40%，C基因组来源基因保留率显著更高，在甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中分别达44.39%和36.31%；GO富集显示三个祖先基因组来源的遗传型单拷贝基因功能特征各异，A基因组来源者主要与胞内结构和细胞器相关区室有关，B基因组来源者富集于细胞周期、减数分裂细胞周期、mRNA加工、囊泡介导运输和蛋白结合，C基因组来源者主要与细胞应激响应、基因表达负调控、RNA加工、转录相关过程、含蛋白核复合物和酶结合有关；推断的丢失衍生型单拷贝基因亦呈现亚基因组特异的富集模式，A亚基因组主要富集于细胞过程正调控、细胞组分组装、RNA加工及ncRNA代谢与加工，B亚基因组与细胞过程调控、对醇、脱落酸和酸性化学物质的响应及蛋白激酶活性相关，C亚基因组主要富集于多细胞生物发育、大分子与蛋白修饰、组织发育、植物器官形态发生和水解酶活性。由此表明异源多倍体芸薹属单拷贝基因比例低于二倍体祖先，亲本单拷贝基因保留呈基因组依赖模式。第三，甘蓝型油菜单拷贝基因的进化起源与染色体分布。全基因组共线性分析显示甘蓝型油菜A亚基因组与白菜、C亚基因组与甘蓝之间存在广泛共线性；据此将单拷贝基因分为遗传型（IGs，在二倍体祖先中即为单拷贝并在甘蓝型油菜中保持单拷贝状态）与丢失衍生型（LGs，推断经异源多倍化后一个重复同源拷贝丢失而形成）；两类基因分布于19条组装染色体及若干未锚定scaffold，LGs在多数染色体上多于IGs；在19条染色体上共定位38个IGs和166个LGs，A亚基因组含20个IGs和52个LGs，C亚基因组含18个IGs和114个LGs；A01含IGs最多（7个），A05和A07未检测到IGs，LGs见于所有染色体，C03最多（24个），其次C04（19个）和C02（17个）；LGs在各染色体分析的单拷贝基因中至少占50%，A08两类比例相等，A05和A07检出的单拷贝基因全部为LGs，C亚基因组中LGs比例从C07的60%到C04的95%，且C亚基因组LGs明显多于A亚基因组。由此表明多倍化后重复基因丢失是单拷贝状态重建的重要途径，尤其在C亚基因组。第四，ZS11单拷贝基因转录与转录后调控的预测。在5106个单拷贝基因的1500 bp上游区域共检测到979,316个顺式作用元件、涉及143种元件类型，选取36种代表性元件归为核心启动子元件、激素响应元件、胁迫响应元件、蛋白结合相关元件和组织特异表达元件五类；核心启动子元件最丰富，TATA-box（237,153个）和CAAT-box（188,710个）合计约占全部预测元件的43.5%，另检测到39,661个激素响应元件、39,077个胁迫响应元件、8439个蛋白结合相关元件和5359个组织特异表达元件；用PlantRegMap在3618个单拷贝基因启动子中预测到60,884个潜在转录因子结合位点，涉及36个转录因子家族，ERF、BBR-BPC和MIKC_MADS家族位点数最多（分别为23,313、10,151和4582个），除SBP家族仅预测靶向BnaA09G0001900ZS外，其余35个家族靶向2至1285个单拷贝基因；用psRNATarget预测到92个miRNA与2091个单拷贝基因间的6117个潜在调控关系， miR156、miR395和miR169形成的miRNA–靶标对最多（899、702和678个），miR156、miR395和miR172靶向基因数最多（237、157和141个），3015个单拷贝基因（约占59.0%）无预测miRNA靶标。由此表明ZS11单拷贝基因具有多层潜在调控格局。第五，ZS11单拷贝基因的表达模式与养分缺乏响应。基于组织与发育阶段表达谱，2202个可检测表达的单拷贝基因被分为五个簇：C3（533个，24.2%）偏好于叶片表达，尤其在抽薹和开花期；C5（463个，21.0%）主要与根及其他营养组织相关；C4（388个，17.6%）在种子发育早期（授粉后3–7 d）表达升高；C1（481个，21.8%）偏好于种子发育中期（约14–35 d）；C2（337个，15.3%）在种子发育晚期（尤其35–49 d）表达最显著。低氮、低磷、低钾处理下的4988个基因被分为四簇：C1（824个，16.5%）对低氮和低磷响应有限但在低钾处理后期根系中明显诱导；C3（1386个，27.8%）在叶片和根系中对低氮响应较强；C4（1425个，28.6%）在低磷条件下偏好于叶片诱导；C2（1353个，27.1%）呈现对低磷的早期根系相关响应及低钾下叶片和根系的广泛诱导。维恩分析显示共有65个基因在根系相关基因集与三种养分缺乏差异表达基因集中共享，低氮、低磷、低钾特异相关基因分别为583、221和189个，根系相关基因集独有150个；据此选取6个代表性单拷贝基因（包括BnaA09G0594900ZS）进行表达谱分析，显示处理与时间依赖的差异响应。由此表明ZS11单拷贝基因具有显著组织特异性、发育阶段依赖性和对矿质养分缺乏的动态响应。第六，BnaNRA1在养分缺乏诱导的根系构型重塑中的功能鉴定。BnaA09G0594900ZS在对照下转录丰度较低，缺氮和缺磷后根系中明显诱导，位于A亚基因组A09染色体，但未包含在204个具明确亲本共线性关系的单拷贝基因中，无法确切归为IGs或LGs；qRT-PCR证实低氮和低磷下其转录丰度显著升高；三个独立CRISPR/Cas9编辑株系（1271、1270、1269）在第二外显子靶点附近存在不同插入或缺失，均导致移码、C端氨基酸序列改变和翻译提前终止；BnaNRA1编码175个氨基酸蛋白，亚细胞定位预测及瞬时表达分析显示其主要定位于细胞核；养分充足条件下ZS11与bnanra1株系间侧根数和主根长无显著差异，缺氮下编辑株系侧根一般少于ZS11但显著性因等位基因而异，缺磷下三个bnanra1株系侧根数均显著少于ZS11，主根长呈处理和等位基因依赖变异但缺氮或缺磷下无一致差异。由此表明BnaNRA1正向促进养分缺乏下的侧根形成，缺磷条件下效应尤为一致。
讨论部分，关于植物单拷贝基因的进化变异，研究人员指出基因拷贝数由重复、差异保留、假基因化和基因丢失动态塑造，16个物种间单拷贝基因比例的巨大变异与谱系特异的 polyploidization、基因家族扩张、重复保留和随后的二倍化一致；单拷贝蛋白普遍短于多拷贝蛋白，可能反映两类基因功能与结构组成的差异而非拷贝数对蛋白长度的直接影响，不应将较短蛋白长度解释为结构更简单或转录效率更高，预测的核与叶绿体富集也需实验验证并与功能匹配的多拷贝基因比较。关于多倍化与重复丢失重塑芸薹属单拷贝基因，禹氏三角三个异源四倍体种单拷贝基因比例低于二倍体近缘种，符合两个亲本基因组融合初始产生同源基因对的预期，但现今芸薹属基因组还受到芸薹族特异全基因组三倍化和近期异源多倍化及广泛重排与分馏的影响；亲本单拷贝基因在A、B、C基因组间保留不均，C基因组来源基因保留较高提示不同亲本基因组基因经历不同进化命运，但较高保留不应直接解释为C亚基因组普遍优势，因为基因保留与表达优势是不同基因组属性；基于共线性的分类显示丢失衍生型单拷贝基因明显多于遗传型，在204个可确切分类的染色体锚定基因中LGs占约81.4%，支持多倍化后重复丢失是二倍化过程中单拷贝状态重建的重要途径；重复丢失有时具功能意义，如甘蓝型油菜中MSH4拷贝数减少可抑制不良同源异源交换而不破坏正常同源重组，但并非所有LGs都具有适应性，有些可能源于中性分馏、同源异源交换或材料特异结构变异，同源异源交换可同时导致一个亚基因组基因丢失和另一亚基因组拷贝增加，泛基因组研究亦揭示甘蓝和甘蓝型油菜存在广泛存在/缺失变异；由于本研究基于单一参考基因组，单拷贝基因的确切数目与身份应主要在ZS11背景下解读，需与更多高质量基因组比较以判断单个LG为固定进化丢失还是ZS11特异变异。关于单拷贝基因的多样调控与表达模式，启动子分析鉴定出大量核心、激素响应、胁迫响应和组织相关顺式元件，但TATA-box和CAAT-box的高丰度不应解释为调控结构简单或稳定；转录因子结合与miRNA靶标网络提示潜在转录和转录后调控，部分显著miRNA家族已知参与养分响应，如miR169参与缺氮响应、miR156参与缺磷信号、miR395调控硫同化与分配，但预测的调控关系仍属计算假说需实验验证；表达谱揭示单拷贝基因高度异质，包括组织、发育阶段、养分和处理时间依赖模式，提示至少一部分单拷贝基因可能在特定发育或环境条件下执行特化功能，缺乏近缘旁系同源基因是否施加独特调控约束仍待实验确定。关于BnaNRA1参与养分依赖的侧根发育，整合根系表达谱与养分缺乏转录组使BnaNRA1被选作功能鉴定对象，其表达受缺氮和缺磷诱导；养分充足下破坏BnaNRA1未引起一致根系表型，而编辑株系在养分缺乏下侧根形成减少，提示BnaNRA1对基础根系发育并非必需，但在养分有限时参与根系构型可塑性；根系重塑是养分觅食的重要策略，硝酸盐通过ANR1和NRT1.1等养分感知与生长素相关途径调控侧根发育，缺磷通过局部与系统信号协调改变主根生长、侧根形成、根毛发育及整体根系构型，甘蓝型油菜中局部和系统信号均参与低磷根系响应，根系形态性状与氮吸收和生物量积累存在遗传关联，故bnanra1株系的养分依赖表型与侧根可塑性在养分适应中的既定重要性一致；BnaNRA1主要定位于细胞核提示潜在调控作用，但核定位本身不能证明其为转录因子，可能参与蛋白复合体、染色质相关过程或其他核内调控机制，三个编辑等位基因均导致移码和翻译提前终止支持BnaNRA1破坏与表型间的关联，其分子机制仍需进一步实验，遗传互补可确认因果关系，转录组与蛋白互作分析可鉴定下游途径或互作伴侣，测定氮磷吸收、组织养分含量和生物量可判断根系表型是否影响养分获取效率；尽管BnaNRA1位于A亚基因组，其亲本进化起源未能通过本研究共线性分析确切解析，故其功能表型不应解释为特别支持遗传型或丢失衍生型类别的证据。总体而言，本研究显示亲本继承与多倍化后重复丢失共同贡献于甘蓝型油菜中可确切分类单拷贝基因的形成，BnaNRA1的功能鉴定进一步表明单拷贝基因可参与环境响应型发育过程而非仅是基因组分馏的残余产物。
研究结论部分翻译如下：本研究为理解异源四倍体甘蓝型油菜（Brassica napus）单拷贝基因的进化形成与功能意义提供了比较框架。结果支持亲本继承与多倍化后重复基因丢失同为现今单拷贝状态的来源，其中重复丢失是异源多倍化后单拷贝状态重建的重要途径。功能鉴定进一步表明BnaNRA1是一个在养分限制下与侧根发育相关的养分响应型单拷贝基因。总之，这些发现将基因拷贝数的进化动态与甘蓝型油菜环境响应型根系发育联系起来，并为进一步研究单拷贝基因在养分适应中的作用提供了基础。
