## 标题 基于植物鞘氨醇的O-环磷酸衍生物作为抗禾谷镰刀菌（Fusarium asiaticum）的新型抗真菌剂

《Life》：A Phytosphingosine-Based O-Cyclic Phosphate Derivative as a Novel Antifungal Agent Against the Phytopathogenic Fungus Fusarium asiaticum

　　

植物鞘氨醇（phytosphingosine）是一种天然存在于皮肤表层的长链脂肪醇，是构成皮肤结构所必需的神经酰胺（ceramides）的关键组成单元。本研究合成了三种植物鞘氨醇衍生物，即(2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(膦酰氧基)十八烷-2-铵氯化物（I）、(4S,5S)-2-羟基-4-((R)-1-羟基十五烷基)-1,3,2-二氧杂磷杂环己烷-5-铵 2-氧化物氯化物（II）和(2S,3R)-3-羟基-1-(膦酰氧基)十八烷-2-铵氯化物（III），以评价其作为杀真菌剂的潜力。植物鞘氨醇-1-磷酸盐I采用氯磷酸二甲酯（dimethyl chlorophosphate）经一种新型四步磷酸化工艺制备。O-环植物鞘氨醇-1-磷酸盐II通过将Boc保护的植物鞘氨醇与POCl₃环化获得，而Boc保护的鞘氨醇（sphinganine）在温和条件下经氯磷酸二甲酯磷酸化生成鞘氨醇-1-磷酸盐III。化合物I–III的抗真菌活性在体外针对四种植物病原真菌进行评估：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、禾谷镰刀菌（Fusarium asiaticum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。其中，化合物II对禾谷镰刀菌（F. asiaticum）表现出最强的生长抑制活性（IC₅₀ = 27.5 μg/mL）。利用感染苹果进行的体内（in vivo）评价进一步证实了化合物II对禾谷镰刀菌的浓度依赖性抑制活性（IC₅₀ = 108 μg/mL）。形态学分析显示禾谷镰刀菌菌丝结构缩短并出现异常分枝，而化合物II处理与黏附型白色念珠菌（Candida albicans）群体向以酵母型形态为主的浓度依赖性转变相关。针对五种选定真菌酶的计算机（in silico）对接提示化合物II与N-肉豆蔻酰基转移酶（N-myristoyltransferase，NMT）之间存在潜在相互作用，其特征为酰基链结合口袋内预测的疏水相互作用以及可能涉及LEU171的氢键。分子动力学模拟进一步支持所预测的NMT–化合物II复合物的相对稳定性。综上，这些发现凸显了O-环植物鞘氨醇-1-磷酸盐II作为一种有前景的抗真菌候选物，并提示NMT可作为值得进一步实验验证的潜在分子靶点。

## 论文解读

植物病原真菌通过侵染植物的根、茎、叶、花和果实破坏正常生长，引发萎蔫、叶斑、疫病、腐烂和溃疡等症状，严重损害植物健康与农业产量。本研究涉及的四种病原真菌分布广泛且破坏性强：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）可与1400余种植物发生复杂互作，其主要毒素botrydial能迅速使宿主组织坏死，协助菌体快速侵入植物内部；镰刀菌属（Fusarium）真菌通过孢子快速高效传播，在广阔农业区域内迅速侵染大量植株，其中禾谷镰刀菌（Fusarium asiaticum）是引起小麦赤霉病的首要病原菌，并产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，Vomitoxin）及其衍生物和雪腐镰刀菌烯醇等真菌毒素，对食品和饲料构成潜在威胁且危害人畜健康，多国因此实施严格监管；茄病镰刀菌（F. solani）因对温度和湿度适应范围广而能在土壤中长期存活，亦是人类甲真菌病等机会性感染的常见报道病原；立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）适宜在温暖潮湿环境中繁衍，作为腐生菌可在土壤中潜伏至条件有利时侵染植物，其对嘧菌酯（azoxystrobin）等多种杀菌剂的抗性是其危害严重的重要因素之一，且真菌一旦在土壤或植物体内定殖，药剂效果往往下降。因此，开发高效靶向植物病原真菌的新型环境友好型杀菌剂在现代农药研究中至关重要。

植物鞘氨醇是具有2-氨基-1,3,4-三醇官能团的长链碳骨架，为天然存在于皮肤表层的鞘脂基本组成单元。其衍生物植物鞘氨醇-1-磷酸（phytosphingosine-1-phosphate，PhS1P）由鞘氨醇激酶催化生成，属鞘脂家族，广泛存在于真菌、植物及某些哺乳动物组织中，被认为是细胞信号通路和免疫应答等多种生理及病理生理过程的关键调节因子。然而，尽管其生物学意义显著且应用前景广阔，关于PhS1P简洁、可放大合成方法的研究仍十分有限。此外，PhS1P本身在有机溶剂和水中的溶解度均较低，限制了其应用。基于此，研究人员开展了本研究：建立PhS1P的新实用合成路线，并制备溶解性更佳的磷酸盐I；进一步合成两种衍生物以探索新的生物活性；并对新合成衍生物针对上述四种农业重要病原菌进行抗真菌活性评价，对活性最强化合物开展体内试验、哺乳动物细胞毒性评价、与代表性抗真菌药物类别的活性比较、形态学分析以及分子对接与动力学模拟，旨在鉴定具有抗真菌潜力的植物鞘氨醇衍生物并初步揭示其生物活性与可能的分子互作。

在关键技术方法方面，研究人员以市售植物鞘氨醇为起始原料，经N-Boc保护、氯磷酸二甲酯选择性磷酸化、分步脱保护（三氟乙酸脱Boc、三甲基硅烷基溴水解甲酯）及成盐等步骤实现PhS1P及其盐I的克级合成；以POCl₃在吡啶存在下环化Boc保护植物鞘氨醇并经HCl处理制备O-环磷酸盐II；以氯磷酸二甲酯磷酸化Boc保护鞘氨醇后经三甲基硅烷基溴和HCl处理制备盐III；结构经¹H、¹³C、³¹P NMR及高分辨质谱（HRMS）确证。抗真菌活性采用微孔板生长抑制法测定，菌株由韩国农业微生物菌种保藏中心（KACC）提供：灰葡萄孢（KACC 40965）、茄病镰刀菌（KACC 44891）、禾谷镰刀菌（KACC 46429）和立枯丝核菌（KACC 48921），以苯菌灵（benomyl）为阳性对照；并参照临床实验室标准研究所（CLSI）M27-A3和M38-A2指南进行肉汤微量稀释试验，以白色念珠菌SC5314和禾谷镰刀菌为代表菌。细胞毒性以WST-1法和XTT法在3T3-L1成纤维细胞及HEK293A肾上皮细胞中评价。体内试验采用同果园成熟苹果打孔接种孢子悬液，计算生长抑制率。分子对接采用Schr?dinger Maestro的Glide SP模式并以MM-GBSA估算结合自由能，分子动力学（MD）模拟采用Desmond进行200 ns轨迹分析。

研究结果方面，3.1 化学合成：实现了PhS1P的克级合成，从植物鞘氨醇出发总产率61%，其中Boc保护产物1经氯磷酸二甲酯和1-甲基咪唑选择性磷酸化以88%产率得到2；因三甲基硅烷基溴同时脱除Boc与甲酯在克级规模存在副产物难以去除的问题，改为分步脱保护，先以三氟乙酸脱Boc再以三甲基硅烷基溴水解甲酯，以72%产率获得PhS1P，最后经HCl处理得到盐I。盐II经1的POCl₃环化及中间体3的HCl处理两步以83%产率获得，从天然植物鞘氨醇经简洁三步序列、克级规模总产率79%，且所有中间体及终产物均通过简单固化而非硅胶柱层析纯化，凸显该路线的可放大性与成本效益。盐III由已知N-Boc保护鞘氨醇4经氯磷酸二甲酯磷酸化，再依次以三甲基硅烷基溴和HCl处理同步脱除Boc和甲酯而获得。
3.2 合成化合物体外抗真菌活性评价：在6.25–100 μg/mL范围内，三种衍生物中仅化合物II对禾谷镰刀菌表现出最强活性（IC₅₀ = 27.5 μg/mL）；化合物I和III在该浓度范围内未达50%抑制（IC₅₀ > 100 μg/mL）；化合物II对灰葡萄孢和立枯丝核菌活性有限（50 μg/mL未达50%抑制），对茄病镰刀菌在100 μg/mL未达50%抑制，表明其在所测病原谱中对禾谷镰刀菌具有优先活性。CLSI肉汤微量稀释试验中，化合物II在32 μg/mL显著抑制禾谷镰刀菌可见生长，而两性霉素B、泊沙康唑和伏立康唑分别在1、1和4 μg/mL显示显著生长抑制，卡泊芬净则以32 μg/mL的菌丝形态明显改变为评价依据；在白色念珠菌SC5314中，化合物II低至2 μg/mL即可检测到丝状形态减少。细胞毒性方面，3T3-L1成纤维细胞中化合物II至100 μg/mL细胞毒性可忽略；HEK293A细胞在0.1–100 μM范围内未见持续毒性，24 h出现初始剂量依赖性代谢活性下降，48 h细胞恢复，仅最高浓度（100 μM，37.92 μg/mL）在72 h仍有残余降低，提示在与抗真菌活性重叠的浓度范围内哺乳动物细胞毒性有限，但仍需进一步安全性评价。
3.3 构效关系（SAR）分析：六化合物集中仅II给出有限IC₅₀值，其余均>100 μg/mL，故SAR被解读为定性的活性–无活性关系。3/II对比中二者具有相同六元环磷酸骨架，3脱Boc生成II，提示环磷酸系列中脱保护的C2氨基可能有助于II的抗真菌活性；I/II对比保留植物鞘氨醇骨架与脱保护氨基而将磷酸由无环变为环状，I的无活性表明仅氨基脱保护不足，在所考察化合物中活性与环磷酸和脱保护C2氨基共存相关。2与5、I与III的对比因双方均无活性，无法确定C4羟基是否参与活性，需环状鞘氨醇类似物才能在该结构背景下考察该取代基；保守的长链鞘氨醇骨架贯穿整个系列，同样不足以解释II的活性。综上，活性似与环磷酸骨架和脱保护C2氨基的组合相关，但仅II有可测活性，这些观察应视为初步SAR发现而非确定的结构决定因素。
3.4 化合物II体内抗真菌活性评价：在控温控湿条件下进行9天试验，化合物II对禾谷镰刀菌的IC₅₀为108 μg/mL，明显高于体外值，阳性对照苯菌灵体内IC₅₀亦升至7.71 μg/mL；尽管如此，仍观察到清晰的剂量依赖性抑制，化合物II有效保护果实免受侵染。研究人员指出体外以肉汤吸光度、苹果试验以9天后菌落直径作为终点，加之溶剂挥发后与果肉组织成分的相互作用或从伤口部位扩散受限可能降低局部可利用浓度（与梨果实中扩散能力与体内 efficacy 相关的报道一致），化合物稳定性及宿主防御反应亦可能影响体内效果，故两类系统的IC₅₀不应视为可直接比较的内在效力指标。本研究报道了植物鞘氨醇衍生物的高效合成与抗真菌评价，其中结构独特的环状类似物II表现出选择性显著抑制活性，尤其是对禾谷镰刀菌；II与线性对应物之间的生物活性差异提示在所考察的有限系列中环磷酸骨架与抗真菌活性可能存在关联，体内剂量依赖性抑制凸显其作为先导化合物的潜力。
3.5 植物鞘氨醇衍生物对真菌形态的影响：禾谷镰刀菌在多烯类两性霉素B（1 μg/mL）及三唑类泊沙康唑和伏立康唑（分别为1和4 μg/mL）处理后出现形态改变；化合物II在8–32 μg/mL引起菌丝延伸减少和异常分枝，图像分析显示处理后菌丝片段缩短，尤以32 μg/mL明显。以白色念珠菌为二态性人类病原代表，48 h处理并洗涤后，剩余黏附群体呈现从富含丝状向以酵母型为主的浓度依赖性转变，低至2 μg/mL即可检测到变化，4–8 μg/mL渐进转向酵母型为主，≥16 μg/mL时丝状细胞几乎完全消失；化合物I作用明显较弱（32 μg/mL部分减少，≥64 μg/mL几乎完全抑制），化合物III至128 μg/mL无明显减少。上述结果提示化合物II可影响不同真菌物种的形态，但其分子机制仍待阐明。
3.6 化合物II的计算机抗真菌活性研究：针对五种关键抗真菌靶酶（几丁质酶、甾醇14α-去甲基化酶、内切葡聚糖酶I、内聚半乳糖醛酸酶和NMT）进行对接，其中化合物II对NMT表现出最有利的Glide对接评分（?9.5 kcal/mol）和MM-GBSA估算结合能（?111.7 kcal/mol）；但与共结晶配体相比其Glide评分较差（?9.5 vs. ?13.8 kcal/mol），而MM-GBSA结合能略优（?111.7 vs. ?109.4 kcal/mol），研究人员认为该差异可能源于评分函数对溶剂化和受体–配体相互作用处理的不同，排序分歧使无法就相对结合亲和力下定论，结果仅应与NMT存在潜在相互作用相符，而非证明更优结合亲和力或直接抑制NMT。化合物II与肉豆蔻酰辅酶A（myristoyl-CoA）结构相似，尤其具有长脂肪链，对接预测其脂肪链可占据NMT疏水口袋并与肉豆蔻酰辅酶A结合位点周围残基互作，其对接构象与天然酰基链结合区域吻合；化合物I和III因长疏水链亦呈相似结合模式，但仅II被预测与LEU171形成氢键，该残基为构成氧负离子洞的保守关键残基，可复制天然酰基供体的关键相互作用，这可能有助于II更有利的结合取向，并可能与其环状磷酸部分相对于I和III线性磷酸的构象刚性相关。
3.7 分子动力学模拟：对化合物I–III与NMT复合物进行200 ns模拟，化合物II另做两次独立200 ns模拟共三条轨迹（n = 3）。蛋白RMSD总体保持在1–3 ?，提示NMT在所模拟条件下整体结构稳定；原始轨迹中配体RMSD在约150 ns短暂升至约3.80 ?后回落至先前范围，另两条轨迹配体RMSD相对稳定无类似波动，虽支持整体构象行为的可重复性，但该瞬时偏移在缺乏进一步结构分析时无法确证归因于特定构象事件。原始轨迹中配体接触残基平均RMSF为0.85 ?，提示结合口袋内柔性相对有限，而化合物II的原子7–8表现出更大构象柔性；化合物I和III在所模拟中RMSD和RMSF均大于II，可能反映其无环磷酸区域构象柔性更大。相互作用分析显示II与氧负离子洞相关残基PHE170和LEU171保持接触，原始200 ns轨迹中二者接触占有率分别为34.23%和88.82%，包括PHE170参与的π–阳离子相互作用及LEU171参与的氢键或水桥相互作用；I和III的LEU171接触占有率较低，且在所分析模拟条件下未检测到PHE170接触。II的长脂肪链在NMT结合腔内维持疏水相互作用，各残基接触占有率在23.85%–52.55%之间。综上，计算结果表明II可能在NMT活性位点采取相对稳定的结合取向，但并未确立NMT抑制为其作用机制或解释化合物间抗真菌效力差异，仍需生化与遗传学验证。

讨论与结论部分，研究人员总结：植物鞘氨醇-1-磷酸盐衍生物（I–III）通过定制的磷酸化与环化策略被高效合成，化合物I–III的抗真菌活性评价显示化合物II作为针对禾谷镰刀菌等真菌病原的保护剂具有潜力；化合物II改变禾谷镰刀菌菌丝形态并减少黏附白色念珠菌群体的丝状形态，凸显其对真菌形态的影响；其在感染苹果中剂量依赖性抑制真菌生长的效果支持其作为农业杀菌剂的应用潜力；除表型效应外，计算建模提示化合物II可能通过预测的疏水与氢键相互作用与NMT结合，为其潜在分子靶点提供了合理假说；未来研究应优先开展生化与遗传学验证，包括重组NMT酶抑制试验及涉及肉豆蔻酰辅酶A的竞争结合试验，以确定NMT是否参与化合物II的抗真菌活性。