《Agronomy》：First Characterization of Bacillus altitudinis Associated with Potato Tuber Soft Rot in Kazakhstan: Phenotypic Features, Pathogenicity, and Molecular Identification
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马铃薯细菌性软腐病主要与Pectobacterium属和Dickeya属成员相关，而其他细菌类群在该病病因学中的作用仍未得到充分表征。本研究旨在对从哈萨克斯坦表现自然软腐症状的马铃薯块茎中分离获得的一株细菌分离物进行鉴定，并评估其致病潜力。从症状组织中共获得1
马铃薯细菌性软腐病主要与Pectobacterium属和Dickeya属成员相关，而其他细菌类群在该病病因学中的作用仍未得到充分表征。本研究旨在对从哈萨克斯坦表现自然软腐症状的马铃薯块茎中分离获得的一株细菌分离物进行鉴定，并评估其致病潜力。从症状组织中共获得12株细菌分离物，其中仅分离物ZA4在健康块茎伤口接种后能可重复地引起明显的组织软化和浸解（maceration），而阴性对照中病害发展极轻微。典型症状的再现及随后从实验发病组织中重新分离该细菌，满足了Koch法则（Koch’s postulates）的主要标准。基于16S rRNA、gyrB、rpoB和pyrE序列的多位点系统发育分析（multilocus phylogenetic analysis）将分离物ZA4鉴定为Bacillus altitudinis。在5个马铃薯品种和1份品种身份未知的商业样品上测试时，24 h时浸解组织比例约为60%–85%，且在各供试材料间存在差异，48 h时增至95%–98%，表明在生物测定条件下组织浸解进展迅速。ZA4还表现出果胶酶（pectinolytic）、纤维素酶（cellulolytic）、蛋白酶（proteolytic）和淀粉酶（amylolytic）活性。上述结果表明，在人工伤口接种条件下，B. altitudinis ZA4能够诱导受伤马铃薯块茎产生明显的组织浸解和软腐症状。然而，仍需涵盖更大样本量和更广地理范围的更广泛研究，以确定B. altitudinis与哈萨克斯坦马铃薯软腐病相关的发生情况及流行病学意义。
**研究背景与科学问题**
马铃薯（Solanum tuberosum L.）为世界重要粮食作物，产量居小麦、水稻和玉米之后。在哈萨克斯坦，马铃薯为战略性重要农作物，年产量超过260万吨。尽管生产水平相对稳定，细菌性病害仍是限制作物产量、块茎品质和耐贮性的重要因素，在生长季和采后贮藏期间均造成重大损失。马铃薯最重要的细菌性病害包括黑胫病和块茎软腐病，主要由软腐果胶杆菌科（Soft Rot Pectobacteriaceae，SRP）成员引起，其致病菌主要为Pectobacterium属和Dickeya属，具有高毒力、广泛地理分布和重大经济影响。SRP为坏死营养型植物病原菌，其致病性主要与分泌一系列降解植物细胞壁组分的胞外酶有关，导致组织浸解和软腐典型症状。
然而，近期研究表明，与植物组织浸解相关的细菌分类多样性比既往认识更广。Bacillus属个别成员，尤其是Bacillus pumilus群内包括B. pumilus和B. altitudinis的物种，已被报道可引起多种农业和木本植物病害，包括软腐、细菌性叶斑、根茎腐烂和木本组织坏死病斑。这些观察尤值得关注，因为B. pumilus群成员存在于多种环境和植物相关生态位中，许多菌株被鉴定为植物促生或生物防治微生物。因此，该群内的生物学特性可能在菌株水平上存在显著差异，仅从病植物组织回收到Bacillus分离物不足以确定其病因学作用，需通过实验确认致病性并从接种寄主中重新分离。关于B. altitudinis对马铃薯的植物致病潜力信息尤为有限。尽管其与B. pumilus群其他成员系统发育关系密切，且已有报道描述个别B. altitudinis菌株与植物的互作，但其引起马铃薯块茎软腐的能力仍未充分表征。在包括哈萨克斯坦在内的中亚地区，从表现软腐症状的马铃薯块茎中分离的非典型细菌病原数据也十分稀少。据研究人员所知，B. altitudinis此前未在哈萨克斯坦被报道为从自然发病马铃薯块茎中分离并经实验证明可诱导块茎组织浸解的细菌。确定此类分离物的病因学意义，不仅有助于完善对马铃薯软腐相关细菌多样性的认识，也有助于对从病组织中回收到经典SRP病原以外微生物的病例进行准确诊断。
**研究内容与结论**
本研究旨在从哈萨克斯坦马铃薯块茎自然发生的软腐症状中分离细菌菌株，并基于多位点系统发育分析确定其分类地位；随后评估该分离物的水解活性及其在5个马铃薯品种和1份品种身份未知商业样品的人工创伤块茎中诱导软腐症状的能力，并对各供试马铃薯材料间的症状发展进行比较评估。研究结论表明，从表现软腐症状的马铃薯块茎中回收的分离物ZA4被鉴定为Bacillus altitudinis，并可重复引起健康块茎组织的明显浸解；典型症状的再现及随后按Koch法则主要标准进行的细菌重新分离，支持ZA4与该病的病因学关联。该分离物表现出果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶活性，而早期病害发展的严重程度在各供试马铃薯品种间存在差异。据研究人员所知，这是哈萨克斯坦首例与马铃薯软腐病相关的植物致病性B. altitudinis菌株的正式报道。这些发现拓宽了对马铃薯细菌性软腐病病因学多样性的现有认识，并强调需进一步研究ZA4的流行情况、自然侵染途径及其致病性的分子机制。
**主要关键技术方法**
研究人员于2026年1月在哈萨克斯坦阿拉木图州Ili区Zhauqashty村Maria农场单一贮藏马铃薯批次中采集26个表现典型软腐症状的Colombo品种块茎，经表面消毒后自健康与浸解组织过渡区取样，匀浆稀释后涂布马铃薯琼脂（PA）分离纯化，获得12株分离物（ZA1–ZA12），并以营养琼脂（NA）保存。采用人工伤口接种进行初筛及Koch法则验证，以OD
600校准曲线将菌悬液调至约1 × 10
8 CFU mL
?1，每块茎纵切两半，一半接种菌悬液、另一半以无菌水作配对阴性对照。鉴定方面采用革兰染色与光镜观察、6种固体培养基上的菌落形态培养特征描述，以及基于M63-聚半乳糖醛酸（PGA）、羧甲基纤维素（CMC）、脱脂乳和可溶性淀粉平板的水解酶半定量测定。分子鉴定提取基因组DNA，扩增16S rRNA、gyrB、rpoB和pyrE位点并测序，BLASTn比对GenBank；多位点系统发育分析将四基因串联（总长2798 bp），以MUSCLE比对、SequenceMatrix v1.10拼接、MEGA 12最大似然法（ML）建树，K2P为最优模型，1000次自举检验，Bacillus cereus ATCC 14579为外群。不同品种致病性评估于接种后24 h和48 h以ImageJ v1.54进行图像阈值分析量化浸解面积，统计采用三因素混合方差分析（ANOVA）。
**研究结果**
1. 从软腐症状马铃薯块茎中分离细菌分离物并进行初级致病性筛选：自Colombo品种块茎分离纯化12株菌落特征各异的分离物；初筛中仅ZA4可重复引起与自然发病块茎相似的明显症状，表现为接种部位组织明显软化、浸解并伴水浸状病斑，其余11株未见可见软腐症状，阴性对照亦无组织软化、浸解或其他可见改变；自症状组织重新分离到培养特征与原始分离物一致的细菌并经分子分析确认为ZA4，阴性对照组织未回收到相应分离物，为ZA4在人工伤口接种条件下与软腐症状发展的关联提供实验支持。据此选择ZA4开展后续表征。
2. 分离物ZA4的显微与培养-形态学特征：革兰染色显示为革兰阳性杆状细胞；ZA4在全部供试培养基上生长，但菌落与生长特征随培养基组成而异，分离菌落以乳白色、圆形为主，菌落大小、隆起度、表面质地和边缘特征因培养基不同而有差异。在PA上形成众多分离良好、乳白色、圆形、凸起、表面较光滑至略颗粒状、边缘多整齐的菌落，部分较大菌落中央较致密并略有表面异质性；在肉胨琼脂（MPA）上生长丰盛，密集接种区菌落融合成乳白-米色生长物，稀疏区可见单个圆形菌落，表面多光滑至略不平，边缘整齐至略呈波状；在NA上形成众多不透明、乳白色、大小不一的圆形菌落，多为凸起、边缘整齐或略波状，部分较大菌落表面颗粒感更明显并略有皱褶，密集生长区相邻菌落部分融合；在LB上生长丰盛，初生划线区以融合的乳白色生长物为主，低接种密度区可见单个菌落，生长物表面不均一，单个菌落边缘波状或不规则；在左旋糖酐（levan）培养基上沿划线生长丰盛，培养物呈乳黄白色，密集区菌落融合，稀疏区单个菌落多呈圆形、表面光滑有光泽、边缘整齐或略波状，外观较多数其他培养基上的菌落更湿润、更黏稠；在King B（KB）培养基上形成离散的乳白-米色菌落，表面异质性明显，菌落隆起、较干燥粗糙并明显皱褶，多数较大菌落边缘波状或不规则，部分菌落中央皱褶尤为明显。总体而言，ZA4为革兰阳性杆状菌，菌落特征在供试培养基间变异明显。
3. 分离物ZA4的胞外水解活性：ZA4在含相应底物的琼脂培养基上表现果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶活性，以菌落周围形成透明水解圈为证据，并以水解圈直径进行半定量评估。淀粉酶测定中平均水解圈直径最大，达19.90 ± 1.85 mm；蛋白酶测定为17.93 ± 1.68 mm；果胶酶活性平均水解圈直径为12.07 ± 0.60 mm；纤维素酶测定平均直径最小，为6.30 ± 0.75 mm。
4. 分离物ZA4对不同马铃薯品种块茎的致病性：接种ZA4在全部供试马铃薯品种/样品上均诱导明显软腐症状；接种后24 h可见组织软化、变褐和浸解，组织损伤程度因品种而异，浸解面积约占分析切面的59%–85%，以Astana（约85%）和Ulan（约83%）最高，Edem最低（约59%），Bolashak、Zhanaisan和商业样品为中等水平（约73%–75%）。至48 h，全部供试材料组织浸解显著进展，达分析切面的约95%–98%；品种间差异在24 h最为明显，而48 h时ZA4接种样品浸解已扩展至几乎整个分析表面。在两个评估时间点，所有品种/样品中ZA4接种块茎半部的组织浸解均显著高于配对无菌水对照（?ídák校正p < 0.0001）；对照半部未见明显软腐症状，尽管定量图像分析在伤口周围检测到轻微局部组织变化，但明显低于相应ZA4接种半部。
5. 分离物ZA4的分子鉴定与多位点系统发育分析：多位点系统发育分析中，ZA4与B. altitudinis参考菌株41KF2b和MCCC1A01287聚类，形成自举支持值100%的强支持分支；参考菌株B. pumilus MCCC1A00439和MCCC1A06996形成100%自举支持的另一分支，B. safensis菌株FO-36b和MCCC1A04526形成自举支持值94%的独立谱系；B. altitudinis与B. pumilus分支归入一个支持值98%的更大强支持类群；Bacillus cereus ATCC 14579占据独立系统发育位置，作为外群使用。
**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管SRP尤其Pectobacterium和Dickeya被视为马铃薯细菌性软腐病主要病原，B. pumilus群某些成员亦有植物致病与浸解活性报道，如自贮藏期软腐块茎分离的B. pumilus菌株Od23经人工接种可再现典型症状且严重度因品种而异，Yahyaoui等从病块茎中鉴定出引起组织浸解并具果胶酶、蛋白酶、淀粉酶及不同程度纤维素酶活性的B. pumilus分离物，说明浸解马铃薯组织的能力并不限于经典软腐病原。B. altitudinis亦有植物致病性报道：Kumvinit和Akarapisan从表现黑胫和软腐症状的马铃薯植株中分离到该种两株菌，人工接种后引起叶片黄化、萎蔫及随后组织损伤；个别B. altitudinis菌株可诱导苹果、梨等寄主浸解或坏死病斑；菌株B10全基因组分析揭示其具有广泛的假定碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzyme，CAZyme）蛋白库，可能参与植物多糖的修饰与降解；该种还与石榴种子腐烂和草莓叶斑相关。这些研究表明B. altitudinis的植物致病性高度依赖菌株，且不局限于单一寄主或症状类型。
本研究结果应在此菌株特异性背景下解读。12株分离物中仅ZA4可重复诱导健康马铃薯组织明显软化与浸解，说明仅从病组织回收到细菌不足以确定其为自然症状的病因，ZA4的致病特性不应推广至B. altitudinis整个种。ZA4的致病潜力还得到重新分离与再接种实验支持：该菌最初自自然发病块茎回收，伤口接种后可重复诱导软腐症状，自实验病斑重新分离并经理化确认，再次接种健康块茎组织后重现相似症状，符合本研究伤口接种模型下Koch法则的关键实验标准；但这些结果不能确定自然侵染途径，也不能证明ZA4是所采块茎自然软腐症状的病因。ZA4组织浸解进展迅速，品种间差异在24 h最明显，48 h时组织损伤程度接近测定响应上限，此模式可能反映可用组织近乎完全降解所致的天花板效应，而非品种感病性的真正趋同，因而较早的评估对检测症状发展速率差异更有信息量；但若无不同接种压力和实际生产或贮藏条件下的附加试验，这些差异不足以在农艺学意义上将供试品种划分为抗病或感病。所观察到的品种依赖性变异与既往关于病害严重度受菌株特异性性状与寄主反应互作影响的报道一致；更广泛而言，软腐病害严重度由病原毒力、寄主组织生理状态和环境条件的综合效应决定。
基于16S rRNA、gyrB、rpoB和pyrE序列的多位点分析将ZA4与B. altitudinis参考菌株置于一个支持良好的分支中，支持将其分类归属为B. altitudinis，这在B. pumilus群成员系统发育关系密切的背景下尤为重要；但多位点系统发育应被视为分类归属的强有力佐证，而非物种身份的绝对证明，尤其是在种间分化有限的近缘类群中。这一区分尤具意义，因为B. altitudinis更常被描述为内生菌、植物促生菌或生防菌而非植物病原：如菌株AMCC 101304抑制马铃薯疮痂病，P32-3减轻甘薯采后黑腐病，KRS010对Verticillium dahliae表现拮抗活性并增强植物防御反应，GG-22兼具促生与拮抗特性。这些对比鲜明的表型凸显B. altitudinis内部显著的功能异质性，表明单个菌株的有益或致病特性均不应外推至整个种。
对ZA4致病性的解读还须考虑接种方式。本研究将菌悬液直接导入受伤组织，因此实验证明的是ZA4在表面屏障被破坏后能够定殖并广泛浸解马铃薯块茎内部组织，而非证明其能独立穿透完整周皮；其他植物致病性B. altitudinis菌株亦有类似依赖组织损伤的报道。但伤口介导的侵染具有农业相关性，因为收获、分级、运输和贮藏期间的机械损伤可能为细菌定殖提供自然入口。所检测的果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶活性与ZA4降解植物组织组分的能力一致，为其致病潜力提供佐证，但这些测定未证明相应水解系统直接导致植物体内软腐发展；确定这些酶的机制性贡献需定量生化测定、基因表达研究和功能遗传分析。
本研究存在若干局限：ZA4仅自单一调查农场有限数量块茎中回收，数据不足以就B. altitudinis的流行率、其与马铃薯软腐关联频率或在哈萨克斯坦的流行病学意义得出结论；伤口接种模型不能重现自然侵染过程的全部阶段，结果证明的是ZA4在受伤块茎组织中的致病潜力，而未确定其能否侵染完整植株、通过自然途径到达块茎或主要作为田间或采后病原；同样，受控实验条件下观察到的品种差异不应解释为田间抗性或感病性证据；缺少Pectobacterium或Dickeya等特征明确的软腐病原作为阳性对照，也限制了对ZA4与已知软腐病原浸解能力的直接比较；48 h近乎完全的组织浸解降低了后期评估的区分能力；在缺乏全基因组分析的情况下，所观察到的浸解表型目前无法与特定毒力遗传决定因素直接关联；致病性测定仅限于马铃薯，ZA4的寄主范围仍未知，需对其他经济重要植物种开展研究以确定其致病潜力是否限于马铃薯。
尽管存在上述局限，多条独立证据一致支持ZA4的致病潜力：该菌自自然发病块茎中回收，人工伤口接种后可重复诱导软腐症状，可成功重新分离并再接种，表现出与植物组织降解一致的水解活性，并经多位点系统发育分析归属为B. altitudinis。综上，这些发现支持ZA4在所考察的人工伤口接种条件下的致病潜力及其与软腐马铃薯块茎的关联，但未证明ZA4是自然发生病害的病因，也未证明其在自然条件下侵染完整块茎的能力。本研究的创新性在于对哈萨克斯坦一株与软腐马铃薯块茎相关的B. altitudinis分离物进行整合表征，并通过实验证明其在伤口接种后可重复诱导明显组织浸解、随后重新分离及再接种后重现相似症状；据研究人员所知，此类表征此前未在哈萨克斯坦报道；但该结论仅特异性适用于ZA4，并不意味着B. altitudinis与马铃薯软腐广泛相关或在哈萨克斯坦具有既定流行病学意义。后续工作应包括跨独立农场和生产区域的调查、评估ZA4侵染完整块茎的能力及其在贮藏条件下的行为，并对表现对比致病表型的B. altitudinis菌株进行比较全基因组分析，以鉴定与浸解表型相关的遗传决定因素并阐明该生态多样种内功能分化的分子基础。
结论部分译为：本研究从表现软腐症状的马铃薯块茎中回收的分离物ZA4被鉴定为Bacillus altitudinis，并可重复诱导健康块茎组织的明显浸解。典型症状的再现及随后按Koch法则主要标准进行的细菌重新分离，支持ZA4与该病的病因学关联。该分离物表现出果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶活性，而早期病害发展的严重程度在供试马铃薯品种间存在差异。据研究人员所知，这是哈萨克斯坦首例与马铃薯软腐病相关的植物致病性B. altitudinis菌株的正式报道。这些发现拓宽了对马铃薯细菌性软腐病病因学多样性的现有认识，并强调需进一步研究ZA4的流行情况、自然侵染途径及其致病性的分子机制。
