细胞外神经素-ICAM5的偶联通过肌动蛋白重塑促进树突生长

《iScience》：Extracellular neuroligin-ICAM5 coupling drives dendritic growth via actin remodeling

　　亮点：
• ICAM5 是所有人类神经连接蛋白（neuroligins）的直接细胞外结合伙伴
• NLGN3 和 ICAM5 在富含 F-actin 的树突突触外区域汇聚
• ICAM5 增强神经连接蛋白驱动的树突生长，但不显著影响突触生成
• ICAM5 支持 PAK 和 coilin 信号通路以及树突生长锥中的 F-actin 组织

摘要：
神经连接蛋白（NLGNs）通过多种相互作用伙伴来组织神经元连接，但细胞外识别如何与细胞内生长程序耦合仍然不清楚。通过亲和蛋白组学研究，我们发现细胞间粘附分子-5（ICAM5）是一种定位于树突伪足的细胞表面蛋白，它是 NLGN 的相互作用伙伴。表面等离子共振和基于细胞的实验表明 ICAM5 与 NLGN3 的细胞外结构域直接结合，并且 ICAM5 可以与所有 NLGN 亚型结合。在神经元中，NLGN3 和 ICAM5 优先定位于富含 F-actin 的突触外树突区域，这意味着这种相互作用与活跃的细胞骨架重组和生长相关。因此，ICAM5 显著增强了 NLGN 诱导的树突生长，但 NLGN3-ICAM5 复合物并未显著促进突触生成。从机制上看，ICAM5 维持了生长锥中的 PAK 和 coilin 信号通路以及 F-actin 的组织，将其定位为连接 NLGN 与 actin 重塑的调节因子。这些发现共同定义了一个 NLGN-ICAM5 轴，该轴将细胞外识别与细胞内细胞骨架重塑联系起来，从而控制神经元的结构发育。

引言：
大脑中的突触形成和发展依赖于复杂的细胞粘附分子（CAMs）网络，这些分子介导突触间相互作用并组织突触前和突触后的特化。这些粘附系统不仅确立了突触的身份，还协调了对神经元连接性和功能至关重要的细胞内信号级联。其中，神经连接蛋白（NLGNs）- 神经连接蛋白受体（NRXNs）轴是突触特化的典型粘附系统。突触后的 NLGNs 通过与可变剪接调控的突触前 NRXNs 相互作用，实现兴奋性和抑制性突触的亚型特异性调节。除了突触间的 NRXN 结合外，NLGN 信号还受到 cis-作用调节因子的精细调控。MAM（Meprin、A5 蛋白和受体型蛋白酪氨酸磷酸酶 Mu）结构域含有糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（MDGAs）的成员在突触后膜上结合 NLGNs 并抑制它们与 NRXNs 的相互作用，从而抑制突触生成。MDGA 的结合位置与 NLGN 外显子域（ECD）上的 NRXN 接口重叠，形成一种竞争机制，微调突触形成并维持突触平衡。通过这种抑制性调节，MDGAs 作为 NLGN 依赖性突触特化的负调节因子发挥作用。

NLGN-3（NLGN3）是 NLGN 家族中特别有趣的成员，因为它既定位于兴奋性突触也定位于抑制性突触，并且与神经发育障碍有密切关联。NLGN3 的突变，尤其是 R451C 突变，最初在 X-连锁自闭症谱系障碍（ASD）家族中被发现，表明 NLGNs 是重要的遗传风险因素。携带 NLGN3 R451C 突变的鼠模型再现了关键的行为表型，包括社交沟通受损和重复行为增加，以及内源性大麻素信号的改变。与皮层中的抑制作用增强相反，R451C 突变在海马回路中增强了兴奋性传递，增加了 AMPA 受体介导的反应，并增强了长时程增强（LTP），突显了 NLGN3 对突触强度和可塑性的区域特异性和回路特异性影响。

进一步强调 NLGN3 作为突触功能关键调节因子的作用的是，受体蛋白酪氨酸磷酸酶 δ（RPTPδ/PTPRD）已成为 NLGN3 的“非经典”突触前配体，与经典的突触前 NRXN 配体并存。RPTPδ 的剪接变体在 NLGN ECD 上的 NRXN 接口附近结合 NLGN3，形成互斥的粘附复合物。体内阻断这一 RPTPδ-NLGN3 通路会改变社交行为、运动学习和突触蛋白表达，模仿 NLGN3 R451C 表型的行为和分子特征。经典的 NLGN3-NRXN 路径和非经典的 NLGN3-RPTPδ 路径对社会动机和记忆形成有不同的、部分相反的贡献。在独特的功能和病理背景下，可溶性 NLGN3 ECD 在肿瘤微环境（TME）中作为有丝分裂原起作用。神经元活动诱导 NLGN3 的蛋白酶解脱落，通过激活 PI3K-mTOR 通路和致癌基因程序促进高级胶质瘤（HGG）的增殖。这种有丝分裂原活性与软骨素硫酸盐蛋白聚糖 CSPG4（NG2）作为受体的结合有关，从而将活性依赖的 NLGN3 脱落与 CSPG4 依赖的信号传导、ADAM10 激活和肿瘤增殖联系起来。NLGN3 的多种突触和非突触功能，以及非经典配体的出现，表明可能存在其他细胞外伙伴参与其功能调节。为了探索这一可能性，我们使用 NLGN3 ECD 进行了全脑突触体的亲和蛋白组学筛选，发现了细胞间粘附分子-5（ICAM5）（也称为 telencephalin；TLN）作为新的 NLGN3 结合伙伴。ICAM5 是一种免疫球蛋白超家族（IgSF）粘附分子，在皮质和海马神经元中丰富，它定位于树突伪足并调节树突生长和棘突成熟。我们证明 ICAM5 直接与所有 NLGN 亚型结合，并显示 NLGN3 和 ICAM5 优先定位于富含 F-actin 的突触外树突区域，将这种相互作用与活跃的细胞骨架重组和生长相关联。功能上，ICAM5 显著增强了 NLGN 驱动的树突生长。我们的发现定义了一个 NLGN-ICAM5 信号轴，将细胞外粘附与神经元结构发育过程中的 PAK 和 coilin 依赖的 actin 重塑联系起来。

结果：
ICAM5 是 NLGN3 的结合伙伴
为了识别 NLGN3 之前未被识别的细胞外结合伙伴，我们使用纯化的重组 Fc 连接的 NLGN3 ECD（NLGN3ECD-Fc）作为 bait，从用去垢剂溶解的来自全鼠脑的突触体中分离相互作用蛋白，随后进行质谱（MS）分析。在 NLGN3 拉下实验中回收的细胞表面蛋白集合中，ICAM5（一种富含树突的粘附分子）是最突出的候选者之一，出现了 21 次光谱计数（图 1A；表 S1）。为了独立验证这种相互作用，我们使用重组纯化的 ICAM5ECD-Fc 作为 bait 进行了互Pull-down 实验。在这种相互作用组中，NLGN3 被检测到 7 次光谱计数，这与 NLGN3-ICAM5 的蛋白质-蛋白质相互作用一致（图 1A；表 S1）。已知的 NLGN3 相互作用蛋白 RPTPδ 在两次拉下实验中都被检测到，为实验策略提供了内部验证。相比之下，NRXNs 在 NLGN3 数据集中被检测到，但在 ICAM5 数据集中未被检测到，因此不包含在交集分析中。MDGA 家族成员在 NLGN3 数据集中未被检测到。

图 1 ICAM5 作为 NLGN3 相互作用蛋白的鉴定
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图查看器：
(A) 在出生后第 23 天大鼠脑制备的用去垢剂溶解的突触体中，从 NLGN3ECD-Fc 和 ICAM5ECD-Fc 亲和纯化中鉴定出的蛋白质的肽检测频率（总光谱计数），在仅 Fc 对照中扣除已检测到的蛋白质后。ICAM5 在 NLGN3-Fc 数据集中被检测到 21 次光谱计数，在 ICAM5-Fc 数据集中被检测到 548 次光谱计数，而 NLGN3 在 NLGN3-Fc 数据集中被检测到 3,308 次光谱计数，在 ICAM5-Fc 数据集中被检测到 7 次光谱计数。每个点代表在两个数据集中都被检测到的蛋白质，并根据其在各自拉下实验中的光谱计数进行绘制。
(B) 细胞表面结合试验。NLGN3ECD-Fc（红色）与表达 HA 标记的 ICAM5 的 HEK293T 细胞（绿色）结合，也与表达 HA 标记的 β-NRXN1 或 MDGA1 的细胞结合（阳性对照）。相反，NLGN3ECD-Fc 不与表达 GFP 的细胞结合，Fc 也不与表达 ICAM5 的细胞结合（阴性对照）。刻度条，5 μm。为了量化，Fc 结合区域根据 GFP 或 HA 染色确定的相应 HEK293T 细胞面积进行归一化。数据以箱线图显示（中位数，第 25–75 百分位数范围，最小值到最大值）。**???p = 0.0002 和 **???p < 0.0001（Kruskal-Wallis 检验后进行 Dunn 的多重比较检验）。数据来自 2 到 6 次独立实验，分别分析了 20（GFP）、30（β-NRXN1）、50（MDGA1）、61（ICAM5 + NLGN3ECD）或 60（ICAM5 + Fc）细胞。a.u.，任意单位。
(C) 表面等离子共振（SPR）分析人类 NLGN3 外显子域（NLGN3ECD）与其相互作用伙伴之间的直接结合。重组二聚体 NLGN3ECD 以 2 倍稀释系列（100 μM–12 nM）注射到表面固定的人类 β-NRXN1(–SS4)LNS6、MDGA1ECD、PTPRδ(+meA3–meB)Ig123-Fn1 或 ICAM5ECD 上。显示传感器图（左）和相应的结合等温线（右）。注释了表观解离常数（KD,app，具有 95% 的置信区间）。
(D) 细胞表面结合试验。NLGN3ECD-Fc（红色）与表达 HA 标记的 ICAM5 的 HEK293T 细胞（绿色）结合，但不与表达 ICAM1、ICAM2 或 ICAM3 ECD 的细胞结合。刻度条，5 μm。为了量化，Fc 结合区域根据 GFP 或 HA 染色确定的相应 HEK293T 细胞面积进行归一化。数据以箱线图显示（中位数，第 25–75 百分位数，最小值到最大值）。**????p < 0.0001（Kruskal-Wallis 检验后进行 Dunn 的多重比较检验）。数据来自 3 次独立实验，分别分析了 33（ICAM1）、29（ICAM2）、35（ICAM3）或 32（ICAM5）细胞。a.u.，任意单位。另见图 S1。

为了确证蛋白质组学结果并研究 NLGN3-ICAM5 的直接相互作用，我们进行了细胞表面结合和表面等离子共振（SPR）试验。首先，我们在 HEK293T 细胞中表达了膜锚定的、带有血凝素（HA）标签的全长（Ig1–9）ICAM5 ECD。然后我们应用 NLGN3ECD-Fc 或仅 Fc（作为阴性对照）并通过免疫细胞化学评估 Fc 与细胞表面的结合。在对照实验中，HEK293T 细胞转染了编码 NLGN3 结合伙伴 β-NRXN1 或 MDGA1 的质粒，或绿色荧光蛋白（GFP），然后用 NLGN3ECD-Fc 处理。NLGN3ECD-Fc 与表达 β-NRXN1、MDGA1 和 ICAM5 的细胞结合，而在表达 GFP 或用 Fc 处理的 ICAM5 细胞中未检测到明显的结合（图 1B），支持 NLGN3 和 ICAM5 ECD 之间的直接相互作用。接下来我们使用纯化的重组 ECD 进行了 SPR 分析。一系列可溶性二聚体 NLGN3ECD（100 μM–12.2 nM）注射到表面固定的全长 ICAM5 ECD、β-NRXN1 LNS6 域（缺少剪接位点 4（SS4）插入；–SS4）、PTPRδIg123-Fn1 或 MDGA1 ECD 上（图 1C）。与之前的结果一致，NLGN3 与 β-NRXN1(–SS4) 的结合具有约 22 μM 的表观解离常数（KD,app），而与 MDGA1 和 PTPRδ 的结合亲和力相似，约为 15–16 μM。与 ICAM5 的直接结合可以检测到，但明显较弱，KD,app 为约 30 μM（95% 置信区间 [CI]：26.6–35.2 μM），并且解离动力学非常快。这些结果确定 ICAM5 是 NLGN3 的直接但低亲和力的结合伙伴，并揭示了一个一致的模式，即在这里测试的 NLGN3 的细胞外结合伙伴是暂时性的，这一特征可能允许在神经元膜上动态交换伙伴和依赖于上下文的信号传导。然后我们研究了 ICAM5 的九个 Ig 结构域（Ig1–9）中的哪一个介导 NLGN3-ICAM5 相互作用。在表达 ICAM5 Ig1 或 Ig1–3 的 HEK293T 细胞中，我们观察到中等程度的结合水平，而在表达 Ig2、Ig3、Ig2–3 或 Ig4–9 的细胞中没有检测到结合（图 S1A 和 S1B）。这些结果表明 Ig1 对 NLGN3-ICAM5 相互作用是必需的，但不足以完全再现全长 ECD 的结合，表明其完整的结构对于最佳相互作用是必要的。接下来我们询问 Ig1 是否也参与 ICAM5 与其他 NLGN 亚型的相互作用。比较全长 ICAM5 与仅有 Ig1 的构建物的结合实验表明，Ig1 仍能与 NLGN1、NLGN2、NLGN3 和 NLGN4X 结合，尽管程度低于全长 ICAM5（图 S1C 和 S1D）。因此，N-末端 Ig1 结构域似乎为 NLGNs 提供了一个共同的识别元件，而其他 ICAM5 结构域则有助于最佳结合。值得注意的是，整合素 αLβ2 与 ICAM5 的 N-末端 Ig1–2 结构域结合，表明 ICAM5 的膜远端部分是其不同细胞外伙伴的公共识别平台。最后，为了评估 NLGN3 是否可能与其他神经元 ICAMs 相互作用，我们通过表达 ICAM1、ICAM2、ICAM3 或 ICAM5 的膜锚定 ECD 进行了细胞表面结合试验（图 1D）。ICAM4 未包括在内，因为它是一种红系细胞特有的粘附分子，在神经系统中不表达。仅检测到与 ICAM5 的结合（图 1D），表明 NLGN3 选择性地识别 ICAM5。

所有神经连接蛋白都可以与 ICAM5 结合
为了确认 ICAM5 的识别是否仅限于 NLGN3 或在 NLGN 家族中共同存在，我们使用 NLGN1–3、NLGN4X 和 NLGN4Y 的 ECDs 进行了 SPR 实验。用可溶性重组 ICAM5ECD（Ig1–9）（50 μM–12.2 nM）的系列稀释液探测表面固定的 NLGN ECDs（NLGN1–3、NLGN4X 和 NLGN4Y），在所有 NLGN 亚型中均产生了明显的浓度依赖性结合反应。ICAM5 与 β-NRXN1 或 MDGA1 的结合反应明显较弱，表观 KD > 10 μM（图 2）。有趣的是，基于表观结合反应，NLGN1 和 NLGN2 与 ICAM5 的结合比 NLGN3 更强。在 NLGNs 中，NLGN1 和 NLGN2 也与 β-NRXN1（KD ～0.8 μM）和 MDGA1（KD ～1.3 μM）的结合最强，建立了这些配体之间一致的亲和模式。尽管NLGN1和NLGN2在脑组织中含量很高，但在相互作用实验中并未从中回收到这些蛋白（图1A；表S1），这表明在自然条件下，ICAM5与这些同种的结合可能较为有限。总之，虽然ICAM5能够与所有NLGNs结合，但这种相互作用比与NRXN或MDGA的结合要弱得多，并且在不同NLGN同种之间也存在差异。图2显示所有神经联结蛋白的外显域都能与ICAM5的外显域结合。

为了研究NLGN3和ICAM5在神经元中的空间关系，我们首先验证了针对ICAM5和NLGN3的商用抗体。通过使用来自相应敲除（KO）小鼠的海马体神经元，我们发现这些抗体在敲除细胞中的免疫反应明显低于野生型（WT）细胞，这支持了在我们采用的免疫细胞化学条件下的特异性。利用这些经过验证的抗体，我们观察了DIV14阶段海马体神经元中NLGN3和ICAM5的分布情况。结果表明，这两种蛋白都主要存在于树突区域，并且有一部分NLGN3与ICAM5共定位，这种空间重叠与它们在树突内的相互作用一致。接下来，我们进一步探讨了这些共定位部位是否与已建立的兴奋性或抑制性突触特化有关。共免疫染色结果显示，NLGN3-ICAM5阳性点既存在于突触内也存在于突触外区域，其中大部分位于突触外部位，这表明NLGN3-ICAM5的相互作用主要发生在突触外。

由于ICAM5在树突伪足中富集，我们接下来探讨了NLGN3-ICAM5共定位是否主要发生在富含F-actin的树突区域。为此，我们使用了带有表位标签的NLGN3和ICAM5，并在非渗透条件下进行活细胞表面标记或在渗透条件下进行免疫染色，以便区分表面和总蛋白池。结果发现，NLGN3-ICAM5在F-actin阳性区域内的共定位显著增加，这表明这种相互作用与活跃的细胞骨架重塑和树突生长有关。

由于NLGN3和ICAM5都参与了兴奋性突触的形成，我们首先考虑了NLGN3-ICAM5相互作用是否有助于调节兴奋性突触的组装。为此，我们在来自WT或Icam5 KO小鼠的海马体神经元中表达了GFP，并量化了兴奋性突触标记物PSD-95的荧光强度。结果发现，NLGN3的过表达增加了PSD-95的强度，而ICAM5的过表达则降低了其强度。相反，任一分子的基因敲除都产生了与其过表达相反的现象。此外，我们发现ICAM5并不显著影响NLGNs的突触发生能力。进一步的研究表明，ICAM5并不参与NLGNs诱导的突触发生过程。

在没有NLGN3的情况下，ICAM5仍然能够促进树突生长，这表明它们的关系可能是独立但协同的，而不是严格的线性信号通路。为了进一步探究ICAM5对神经联结蛋白诱导的树突生长的作用，我们发现ICAM5还参与了早期神经元发育阶段。因此，我们在来自WT或Nlgn3 KO小鼠的海马体神经元中表达了GFP，并分析了总树突长度。结果表明，ICAM5确实可以促进树突生长，即使在没有NLGN3的情况下也是如此。此外，我们还发现多个NLGN同种也能以ICAM5依赖的方式促进树突生长。裂解物被检测了mTOR信号传导的标记物（4E-BP1和phospho-4E-BP1 [Thr37/46]）、PI3K信号传导（Akt和phospho-Akt [Ser473]）、PAK信号传导（总PAK1–3和phospho-PAK1 [Ser144]/phospho-PAK2 [Ser141]），以及肌动蛋白调节因子cofilin（总cofilin和phospho-cofilin [Ser3]）。βIII-微管蛋白被用作负荷对照，ICAM5免疫印迹证实了Icam5 KO神经元中ICAM5表达的丧失。- 图A的量化：磷酸化条带的强度被标准化到相应的总蛋白水平以及WT对照，而总蛋白条带的强度被标准化到βIII-微管蛋白和WT对照。数据以单个数据点显示，平均值±标准误（SEM）。?p < 0.05和??p < 0.01（非配对t检验，4-5次独立实验）。- 图C：DIV7 WT或Icam5 KO小鼠皮层神经元的代表图像，这些神经元被免疫染色显示phospho-PAK（p-PAK1 Ser144/p-PAK2 Ser141；灰度）、F-actin（phalloidin；洋红色和灰度）和MAP2（蓝色）。插图显示了选定生长锥的放大视图。刻度尺分别为10 μm和2 μm（插图）。- 图D：图C的量化：在由phalloidin染色（F-actin）定义的MAP2阳性突起内的phospho-PAK或F-actin强度的量化，并标准化到F-actin面积和WT对照。数据以箱形图显示（中位数、25th-75th百分位数以及最小值到最大值）。?p = 0.0426（Mann-Whitney检验；phospho-PAK）和??p = 0.0018（非配对t检验；F-actin）。数据来自3次独立实验，分析了30个（phospho-PAK；WT）、27个（phospho-PAK；KO）、30个（F-actin；WT）或30个（F-actin；KO）细胞。- 图E：提出的示意图展示了NLGN3和ICAM5在神经元发育过程中如何在树突表面协作以调节细胞内信号传导和肌动蛋白细胞骨架的组织。在WT神经元中，NLGN3和ICAM5协作支持PAK-cofilin信号传导，促进F-actin的组装和树突生长。在Icam5 KO神经元中，ICAM5的丧失损害了neuroligin驱动的信号传导，导致PAK-cofilin信号传导受损，F-actin水平降低，突起生长减少。另见图S5。鉴于NLGN3-ICAM5在富含F-actin的树突区域的优先富集（图3C），我们接下来探讨了ICAM5如何参与肌动蛋白细胞骨架的调节。因为ICAM5和PAK都与肌动蛋白结合蛋白cofilin的调节有关，我们首先检查了总cofilin和磷酸化cofilin的水平。Icam5 KO神经元中的总cofilin水平降低，但在Nlgn3 KO神经元中保持不变（图5A、5B、S5C和S5D），这支持了ICAM5在维持PAK和cofilin稳定性中的作用。与这些生化变化一致，phospho-PAK免疫染色和phalloidin标记显示Icam5 KO神经元树突生长锥内的phospho-PAK和F-actin信号分别减少（图5C和5D）。结合NLGN3-ICAM5在富含F-actin的树突区域的优先富集（图3C），这些发现表明ICAM5有助于将促进生长的NLGN信号传导与调节树突生长期间肌动蛋白细胞骨架组织的PAK-cofilin通路联系起来。根据这一模型，ICAM5的丧失，但不是NLGN3的丧失，可能会破坏PAK和cofilin的稳态。ICAM5的丧失还损害了NLGN诱导的树突生长。

讨论
我们确定ICAM5（telencephalin）是NLGN3的直接、低亲和力结合伴侣，更广泛地说，是所有人类NLGNs的结合伴侣。功能上，NLGN-ICAM5轴促进树突生长而不影响突触生成，将生长控制与经典的突触组织功能分开。在神经元中，NLGN3和ICAM5沿着树突共定位，它们的共定位优先发生在突触外位点，并在富含F-actin的树突区域富集（图3）。这种空间组织与NLGN-ICAM5相互作用在局部细胞骨架重塑中的作用一致，而不是在突触组装中的作用。这扩展了NLGNs的细胞外识别范围，超出了NRXNs、MDGAs和RPTPδ。ICAM5的树突定位、在丝状伪足上的富集、调节ECD脱落以及与β1-整合素和细胞骨架适配器的连接，为NLGN参与肌动蛋白机制提供了一条连贯的途径。我们的数据将NLGN结合到PAK-cofilin信号传导和生长锥F-actin组织联系起来，并支持一种模型，即NLGN信号传导由模块化的细胞外识别程序编码：（1）通过NRXNs介导的突触生成指定；（2）通过RPTPδ的非典型突触前耦合；（3）MDGA依赖的突触生成抑制；以及（4）ICAM5介导的树突生长调控。值得注意的是，ICAM5和NLGNs在神经元发育过程中的表达模式与这种作用一致。ICAM5在树突生长的早期阶段在树突丝状伪足中高度富集，并随着突触成熟而减少，而NLGNs在神经元成熟时表达，表明NLGN-ICAM5相互作用可能在将树突形态发生与新兴的突触连接联系起来的发育窗口期间起作用。

ICAM5通过将细胞表面粘附与细胞内信号传导耦合来促进树突生长。ICAM5是一种严格局限于体细胞-树突的粘附分子，在树突丝状伪足和生长锥中富集。这种独特的定位模式使ICAM5在神经元发育中特别相关，特别是在树突生长期间。与这种定位一致，我们的发现表明NLGN3-ICAM5在富含F-actin的树突区域内的共定位（图3C）将NLGN-ICAM5相互作用置于与活跃的细胞骨架重塑和生长相关的位点。实际上，涂有重组ICAM5的基底促进了树突生长，这种效应至少部分是由同源ICAM5相互作用介导的。与这些观察结果一致，我们在这里显示ICAM5过表达增加了总树突长度（图4）。除了同源相互作用的贡献外，ICAM5介导的树突生长还依赖于其细胞质尾部的信号传导，后者与ERM家族的细胞骨架连接蛋白相互作用。这些蛋白进而与肌动蛋白丝结合，作为连接质膜和下方细胞骨架的交叉链接器。值得注意的是，ERM蛋白也在ICAM5相互作用组中被检测到（图S5E；表S1），支持它们与包含ICAM5的复合物的关联。ICAM5与α-actinin和F-actin共定位，破坏ICAM5-α-actinin相互作用会损害ICAM5诱导树突生长的能力。

为了支持ICAM5作为细胞外粘附与肌动蛋白细胞骨架之间分子连接器的作用，我们显示ICAM5缺陷神经元在树突生长锥内的F-actin水平降低。此外，这些神经元显示出cofilin和PAK的总水平降低（图5），这些都是肌动蛋白动态的关键调节因子。与这一观察结果一致，我们的ICAM5相互作用组分析确定了PAK1–3和cofilin 1为ICAM5相关蛋白（图S5E；表S1）。由于相互作用组是使用ICAM5 ECD进行的，这些相互作用可能来源于内源ICAM5与测定中使用的重组ICAM5 bait之间的同源相互作用。目前尚不清楚ICAM5与PAK和cofilin的关联是直接的还是通过额外的适配器蛋白介导的。尽管如此，这些发现支持ICAM5在树突质膜处作为信号中心的作用，协调细胞外粘附线索与调节肌动蛋白细胞骨架的细胞内途径。

总之，我们的数据支持一种模型，即ICAM5通过多种可能的协同机制将细胞表面粘附与肌动蛋白重塑整合起来，从而促进树突生长。这些机制包括与ERM蛋白和α-actinin等肌动蛋白结合蛋白的直接相互作用，以及涉及PAK和cofilin的肌动蛋白调控信号途径的调节。通过这些综合作用，ICAM5能够在树突生长锥内局部控制细胞骨架组织，从而驱动树突形态发生。尽管生物化学检测到的PAK-cofilin信号变化反映了全局细胞变化，但它们对肌动蛋白组织的影响可能是空间上受调节的。与此一致，我们在Icam5 KO神经元树突生长锥内观察到phospho-PAK和F-actin的减少，支持ICAM5在树突生长部位的局部肌动蛋白重塑中的作用。鉴于ICAM5的体细胞-树突定位，这一机制主要可能在树突生长锥而不是轴突生长锥中起作用，尽管不能排除ICAM5独立于NLGNs调节轴突中的PAK-cofilin信号传导的可能性。

Neuroligins调节突起生长
类似于ICAM5，NLGNs，特别是NLGN3和NLGN4X，也被认为参与细胞生长过程的调节，包括突起生长。在原代海马培养物中的功能丧失研究表明，shRNA介导的NLGN3敲低增加了树突生长。NLGN3或NLGN4X的过表达促进了原代皮层神经元以及未分化的人类神经前体细胞的突起生长。与后者的观察结果一致，这里呈现的结果进一步支持NLGNs作为树突生长的正向调节因子。然而，遗传功能丧失研究表明NLGN删除对神经元结构参数的影响相对有限。NLGN1/2/3的组成性删除不会显著改变大脑的总体细胞结构、神经元密度或层状结构，而在培养的神经元中条件性删除NLGNs虽然导致突触功能显著变化，但结构效应有限。这些发现并不一定与上述的生长促进效应矛盾，而是强调了NLGNs促进神经元生长与其在建立基本神经元结构中的必要要求之间的重要区别。因此，我们的发现支持NLGN3的生长促进作用，但不意味着NLGN3对于基本树突形态发生是绝对必需的。

越来越多的证据表明，操纵神经元中的NLGN3表达水平可以调节多种细胞内信号通路，包括PI3K、mTOR、PAK和cofilin，这些都被认为影响细胞生长。与这些研究一致，我们在NLGN3功能丧失后检测到PI3K、mTOR和PAK信号的变化（图S5C和S5D）。这些变化可能通过多种机制影响突起生长，包括蛋白质合成和肌动蛋白细胞骨架的重塑。与此框架一致，据报道NLGN3和NLGN4X的过表达激活了发育中的神经元中的PAK信号传导和cofilin，在这些突起生长锥中这两种蛋白都被富集，并且PAK活性对于NLGNs的突起生长促进效应是必需的。值得注意的是，我们观察到ICAM5功能丧失导致PAK和cofilin水平显著降低（图5），表明ICAM5对这些信号通路的NLGN依赖性激活有贡献。然而，我们的遗传相互作用实验表明NLGNs和ICAM5之间的功能关系是协作的而不是严格线性的。尽管ICAM5的丧失显著减弱了NLGN3和NLGN4X诱导的树突生长，但它并没有消除NLGN3的生长促进效应，表明NLGN3也可以独立于ICAM5调节树突生长。相反，ICAM5过表达在Nlgn3 KO神经元中显著促进了树突生长，表明ICAM5独立于NLGN3保留了生长促进活性。结合ICAM5对PAK-cofilin信号和F-actin组织的显著影响，这些观察结果支持ICAM5独立于NLGN3调节树突生长和细胞骨架重塑的能力。然而，因为ICAM5与多种NLGN异构体相互作用，ICAM5介导的PAK-cofilin信号传导是否完全独立于更广泛的NLGN家族还有待确定。总体而言，这些发现支持NLGNs和ICAM5具有部分独立的生长促进活性，而它们的功能协作增强了控制肌动蛋白重塑和树突生长的信号通路。在这个框架中，ICAM5可能作为调节器，促进或放大NLGN依赖的生长信号传导，而不仅仅是作为必要的下游效应器（图5E）。

更广泛地说，这些观察结果与突触导向的树突生长概念一致，在这种概念中，树突分支和稳定受到早期神经元发育过程中突触粘附线索的影响。我们的发现表明NLGN3-ICAM5的共定位优先发生在突触外位点（图3B），进一步表明NLGN依赖的生长信号传导可以在已建立的突触特化之外发挥作用。在这种情况下，NLGNs可能不仅通过其在突触形成中的已知作用，还通过局部调节发育中的树突生长锥的细胞骨架动力学来促进树突形态发生。除了在神经元发育过程中调节细胞内信号传导的作用外，神经元衍生的分泌NLGN3已被证明通过激活PI3K-mTOR信号通路来促进胶质瘤细胞增殖，这突显了NLGN3在促进生长信号级联中的更广泛能力。ICAM5是否对于激活促进NLGN3依赖的胶质瘤细胞增殖的信号通路是必需的仍是一个未解之谜。

Neurolgins调节突起生长
与ICAM5类似，NLGNs，特别是NLGN3和NLGN4X，也被认为参与细胞生长过程的调节，包括突起生长。在原代海马培养物中的功能丧失研究表明，shRNA介导的NLGN3敲低增加了树突生长。NLGN3或NLGN4X的过表达促进了原代皮层神经元以及未分化的成人神经前体细胞的突起生长。与后者的观察结果一致，这里呈现的结果进一步支持NLGNs作为树突生长的正向调节因子。然而，遗传功能丧失研究表明NLGN删除对神经元结构参数的影响相对有限。NLGN1/2/3的组成性删除不会显著改变大脑的总体细胞结构、神经元密度或层状结构，而在培养的神经元中条件性删除NLGNs虽然导致突触功能明显改变，但结构效应有限。这些发现并不一定与上述的生长促进效应相矛盾，而是强调了NLGNs促进神经元生长的能力与建立基本神经元结构之间的重要区别。因此，我们的发现支持NLGN3的生长促进作用，但不意味着NLGN3对于基本树突形态发生是绝对必需的。

越来越多的证据表明，操纵神经元中的NLGN3表达水平可以调节多种细胞内信号通路，包括PI3K、mTOR、PAK和cofilin，这些已被认为会影响细胞生长。与这些研究一致，我们在NLGN3功能丧失后检测到PI3K、mTOR和PAK信号的变化（图S5C和S5D）。这些变化可能通过多种机制影响突起生长，包括蛋白质合成和肌动蛋白细胞骨架的重塑。与这一框架一致，据报道NLGN3和NLGN4X的过表达激活了发育中的神经元中的PAK信号传导和cofilin，这两种蛋白在突起生长锥中富集，PAK活性对于NLGNs的突起生长促进效应是必需的。值得注意的是，我们观察到ICAM5功能丧失导致PAK和cofilin水平显著降低（图5），表明ICAM5对这些信号通路的NLGN依赖性激活有贡献。然而，我们的遗传相互作用实验表明NLGNs和ICAM5之间的功能关系是协作的而不是严格的线性关系。尽管ICAM5的丧失显著减弱了NLGN3和NLGN4X诱导的树突生长，但它并没有消除NLGN3的生长促进效应，表明NLGN3也可以独立于ICAM5调节树突生长。相反，ICAM5过表达在Nlgn3 KO神经元中显著促进了树突生长，证明ICAM5独立于NLGN3保留了生长促进活性。结合ICAM5对PAK-cofilin信号和F-actin组织的显著影响，这些观察结果支持ICAM5独立于NLGN3调节树突生长和细胞骨架重塑的能力。然而，因为ICAM5与多种NLGN异构体相互作用，ICAM5介导的PAK-cofilin信号传导是否完全独立于更广泛的NLGN家族仍有待确定。总之，这些发现支持NLGNs和ICAM5具有部分独立的生长促进活性，而它们的功能协作增强了控制肌动蛋白重塑和树突生长的信号通路。在这个框架中，ICAM5可能作为调节器，促进或放大NLGN依赖的生长信号传导，而不是作为必要的下游效应器（图5E）。

更广泛地说，这些观察结果与突触导向的树突生长概念一致，在这种概念中，树突分支和稳定受到早期神经元发育过程中突触粘附线索的影响。我们的发现表明NLGN3-ICAM5的共定位优先发生在突触外位点（图3B），进一步表明NLGN依赖的生长信号传导可以在已建立的突触特化之外发挥作用。在这种情况下，NLGNs可能不仅通过其在突触形成中的已知作用，还通过局部调节发育中的树突生长锥的细胞骨架动力学来促进树突形态发生。更广泛地说，这些发现展示了细胞外基质（CAMs）如何将细胞外识别与细胞内信号传导相结合，以塑造神经元结构。

研究的局限性
我们的生物物理结论是基于使用重组ECDs进行的SPR实验得出的；因此，报告的KD值反映了体外低亲和力结合能力，可能无法直接转化为体内的情况。在体内环境中，二维限制、局部拷贝数和化学计量比、膜组织以及拥挤都会改变有效的结合和解离速率以及亲和力。这些相互作用的非常低的亲和力和快速的解离动力学使得无法分离出足够稳定的复合物用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）或晶体结构测定，而计算结构预测也没有产生高置信度或可解释的相互作用界面模型。因此，我们无法确定ICAM5和其他细胞外NLGN配体是否使用重叠或不同的结合界面，从而无法确定它们与NLGNs的结合是相互排斥还是兼容的。

功能分析依赖于在啮齿动物皮层培养中的过表达和完全敲除；因此，观察到的促进生长的效应的大小可能并不直接反映内源性表达水平下的NLGN或ICAM5活性，而使用组成型KO模型可能会允许发育补偿机制来减轻长期蛋白质丢失的后果。我们没有进行体内功能丧失或敲入修复实验，也没有进行树突成熟、电路连接或行为的纵向分析。因此，未来使用内源性蛋白质水平操纵、急性或条件性功能丧失方法以及修复实验的研究对于确定NLGN-ICAM5相互作用对树突生长的生理贡献非常重要，同时要尽量减少潜在的发育补偿效应和过表达相关的伪影。此外，我们的实验是在未经亚型选择的混合皮层神经元培养中进行的。因此，神经元亚型的异质性可能导致树突形态的变异性，而我们的群体水平分析可能无法检测到仅限于特定神经元亚型的效应。未来使用定义明确的神经元群体或亚型特异性标记物的研究将有助于确定NLGN-ICAM5信号在不同神经元亚型间的差异。

机制上，PAK-胶原纤维蛋白轴是通过蛋白质/磷酸化水平和生长锥F-actin推断出来的；因果充分性（例如，PAK修复）仍有待确定。最后，我们没有对NLGNs与其他已知的ICAM5配体（例如β1整合素）进行竞争或直接比较，也无法确定ICAM5是否与NRXN或RPTPδ竞争NLGN的结合位点。因此，虽然我们确定了直接的结合能力和与生长相关的表型，但这些细胞外相互作用在更广泛的NLGN和ICAM5相互作用网络中的协调机制仍然不清楚，需要进一步的研究。

资源可用性
如需更多信息和资源以及试剂，请联系主要联系人Luís F. Ribeiro（[e-mail]）。

材料可用性
本研究生成的所有独特试剂均列在关键资源表中，并可在完成材料转移协议的情況下从主要联系人处获得。如需重新分析本文报告的数据所需的任何额外信息，也可向主要联系人请求。

数据和代码可用性
•本文报告的所有数据均可在文章及其补充信息中找到。
•如需重新分析本文报告的数据所需的任何额外信息，可向主要联系人请求。
•本研究没有生成原始代码。

致谢
本工作得到了欧洲研究委员会（ERC）的启动资助（项目编号850820 SynLink）和新阿基坦地区（Région Nouvelle-Aquitaine）的资助（项目编号3428720，给予J.E.）；以及欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新计划（项目编号857524）、Marie Sk?odowska-Curie资助（项目编号101031398）、葡萄牙科学技术基金会（FCT：PTDC/BIA-CEL/2286/2020）的国家资金以及FWO的博士后资助（项目编号12N0319N，给予L.F.R.）的支持；此外还得到了FWO项目资助（项目编号G0C4518N、G0A8720N和G0A8320N、FWO EOS资助（项目编号G0H2818N）以及ERANET-NEURON TAO2PATHY资助（项目编号G0I3118N，给予J.d.W.）。我们还要感谢CNC-UC的MICC成像设施的支持，该设施部分由葡萄牙生物成像平台（PPBI；PPBI-POCI-01–0145-FEDER-022122）资助。我们还要感谢Nils Brose博士（马克斯普朗克多学科科学研究所）提供Nlgn3 KO小鼠品系。图形摘要是在BioRender中创建的：Ribeiro, L. (2026) https://BioRender.com/4yxw2f2。

作者贡献
J.d.W.、J.E.和L.F.R.构思了该项目并设计了实验。C.G.、B.R.、N.A.、E.B.、J.V.、B.M.、J.F.M.、l.K.、J.N.、E.C.、J.V.、K.W.和L.F.R.进行了实验并分析了数据。J.N.S.进行了质谱分析。W.A.提供了试剂。C.G.、B.R.、N.A.、K.W.、J.N.S.、J.d.W.、J.E.和L.F.R.分析了数据。J.d.W.、J.E.和L.F.R.撰写了论文，并得到了所有作者的 input。

利益声明
J.d.W.是Augustine Therapeutics公司的科学联合创始人，并担任其科学顾问委员会成员。

方法
关键资源表

试剂或资源
来源标识符
抗-GFP，鸡：Aves#GFP-1010；RRID: AB_2307313
抗-GFP，兔：Millipore#AB3080；RRID: AB_91337
抗-HA，兔：Cell Signaling Technology#3724；RRID: AB_1549585
抗-HA，鼠：Roche#ROAHAHA；RRID: AB_2687407
抗-FLAG，鼠：Sigma-Aldrich#F1804；RRID: AB_262044
抗-FLAG，鼠：Sigma-Aldrich#F3165；RRID: AB_259529
抗-FLAG，兔：Sigma-Aldrich#F7425；RRID: AB_439687
抗-MAP2，鸡：Abcam#ab5392；RRID: AB_2138153
抗-MAP2，鸡：Novus Biologicals#NB300-213；RRID: AB_2138178
抗-Synapsin1，兔：Millipore#AB1543P；RRID: AB_90757
抗-PSD-95，鼠：Thermo Fisher Scientific#MA1-046；RRID: AB_2092361
抗-mCherry，鸡：Abcam#ab205402；RRID: AB_2722769
抗-4E-BP1，兔：Cell Signaling Technology#9644；RRID: AB_2097841
抗-phospho-4E-BP1 (Thr37/46)，兔：Cell Signaling Technology#2855；RRID: AB_560835
抗-Akt，鼠：Cell Signaling Technology#2920；RRID: AB_1147620
抗-phospho-Akt (Ser473)，兔：Cell Signaling Technology#4060；RRID: AB_2315049
抗-PAK1/2/3，兔：Cell Signaling Technology#2604；RRID: AB_2160225
抗-phospho-PAK1 (Ser144)/PAK2 (Ser141)，兔：Cell Signaling Technology#2606；RRID: AB_2299279
抗-Cofilin，鼠：Proteintech#66057-1-Ig；RRID: AB_1104333
抗-phospho-Cofilin (Ser3)，兔：Cell Signaling Technology#3311；RRID: AB_330238
抗-Puromycin，鼠：Sigma-Aldrich#MABE343；RRID: AB_2566826
抗-βIII-Tubulin，兔：Abcam#ab18207；RRID: AB_444319
抗-ICAM5，山羊：R&D Systems#AF1173；RRID: AB_2122460
抗-ICAM5，山羊：Novus Biologicals#NB100-53815；RRID: 829163
抗-NLGN3，兔：Synaptic Systems#129 113；RRID: AB_2619816
抗-Gephyrin，豚鼠：Synaptic Systems#147 318；RRID: AB_266177
Phalloidin，Alexa Fluor 555：Thermo Fisher Scientific#A30106
山羊抗鸡IgY (H + L)，CF 405：Sigma-Aldrich#SAB4600466
山羊抗兔IgG (H + L)，Alexa Fluor 405：Thermo Fisher Scientific#A-31556
驴抗兔IgG (H + L)，Alexa Fluor 488：Thermo Fisher Scientific#A-21206
山羊抗鸡IgY (H + L)，Alexa Fluor 488：Thermo Fisher Scientific#A-11039；RRID: AB_2534096
驴抗鼠IgG (H + L)，Alexa 488：Thermo Fisher Scientific#A-21202；RRID: AB_141607
驴抗鼠IgG (H + L)，Alexa Fluor 555：Thermo Fisher Scientific#A-31570；RRID: AB_2536180
山羊抗鼠IgG (H + L)，Alexa Fluor 555：Thermo Fisher Scientific#A-31572；RRID: AB_2536183
驴抗兔IgG (H + L)，Alexa Fluor 647：Thermo Fisher Scientific#A-31571；RRID: AB_234069
驴抗兔IgG (H + L)，Alexa Fluor 647：Thermo Fisher Scientific#A-31573；RRID: AB_2536183
驴抗鼠IgG (H + L)，Alexa Fluor 647：Thermo Fisher Scientific#A-31571；RRID: AB_2340379
驴抗鼠IgG (H + L)，HRP：Thermo Fisher Scientific#65–6120；RRID: AB_2533967
驴抗羊IgG (H + L)，HRP：Thermo Fisher Scientific#62–6520；RRID: AB_88369
兔抗羊IgG (H + L)，HRP：Thermo Fisher Scientific#81–1620；RRID: AB_2534006

细菌和病毒株
5-alpha Competent E. coli：New England Biolabs#C2987
HNEB Stable Competent E. coli：New England Biolabs#C3040H

化学品、肽和重组蛋白
人IgG，Fc片段：Jackson ImmunoResearch#009–000–008；RRID: AB_2337046

NLGN3ECD WT-Fc：本文
ICAM5ECD WT-Fc：本文
β-NRXN1(–SS4)：本文
AMLGN1ECD WT-Fc：本文
APTPRδ(+meA3–meB)Ig123-Fn1 WT：本文

关键的商业试剂
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix：New England Biolabs#E2621L
In-Fusion Snap Assembly Master Mix：Takara Bio#638948

实验模型：
细胞系：HEK293TATCC#CRL-3216；RRID: CVCL_0063
HEK293T TetRLENTI：本文

实验模型：生物体/菌株：
B6.Cg-Nlgn3tm1Bros (Nlgn3全敲除)：N/ARRID: MGI: 4353654
C57BL/6JIcam5(?/?) (Icam5全敲除)：Nakamura等人
Wistar Han IGS鼠：Charles River Laboratories

寡核苷酸：
C57BL/6JIcam5(?/?)_WT_sense:5′-CATCCTCACATTCTCCTTAGAACCACAT-3′：ID
C57BL/6JIcam5(?/?)_WT_antisense:5′-GTGGTGGCAGAAGCGTGGGAAGCTAGAAGA-3′：ID
C57BL/6JIcam5(?/?)_KO_sense:5′-CATCCTCACATTCTCCTCTTAGAACCACAT-3′：ID
C57BL/6JIcam5(?/?)_KO_antisense:5′-GTTCGAACGCTAGAGCCTGTTTTGCACGTT-3′：ID
AB6.Cg-Nlgn3tm1Bros _sense:5′-TCTCTGGACCCCTGGGCACTTGA-3′：ID
AB6.Cg-Nlgn3tm1Bros _WT_antisense:5′-AGGGGGACTGGCAGGAGAGGAAG-3′：ID
AB6.Cg-Nlgn3tm1Bros _KO_antisense:5′-GAGCGCGCGCGGCGGAGTTGTTGAC-3′：ID

重组DNA：
pBOS-EGFP：de Wit等人
pCAG-HA-Nrxn1β(–SS4)：Taniguchi等人
pCMV-HA-MDGA1：Pettem等人
pDisplay-(ms-ecto)ICAM5：本文
pLP-FLAG-(hu-ecto)NLGN3-Fc：本文
pLP-FLAG-(rat-ecto)NLGN1-Fc：本文
pLP-FLAG-(rat-ecto)NLGN2-Fc：本文
pLP-FLAG-(hu-ecto)NLGN4X-Fc：本文
pLP-FLAG-(ms-ecto)ICAM5-Fc：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig1)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig2)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig2)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig3)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig1-3)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig2-3)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig4-9)ICAM5：本文
pCAG-SEP-(hu)NLGN3：本文
pPCDNA3.1(?)：Thermo Fisher Scientific
V79520FUGW-FLAG-(ms)ICAM5：本文
AFUGW-FLAG-(hu)ICAM5：本文
AFUGW-HA-(hu)NLGN3：本文
AFUGW-HA-(hu)NLGN4X：本文
AFUGW-HA-(hu)NLGN4Y：本文
pDisplay-(hu-ecto)ICAM5：本文
pDisplay-(hu-ecto)ICAM1：本文
pDisplay-(hu-ecto)ICAM2：本文
pDisplay-(hu-ecto)ICAM3：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig1)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig2)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig3)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig1-3)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig2-3)ICAM5：本文
pDisplay-(ms-ecto-Ig4-9)ICAM5：本文
pCAG-SEP-(hu)NLGN3：本文
pPCDNA3.1(Zeo+)-ICAM5-Cherry：Raemaekers等人

软件和算法：
GraphPad Prism 10.1.2：GraphPad Software
RRID: SCR_002798
Fiji：Schindelin等人
RRID: SCR_002285
Scrubber v2：BioLogic Software
SnapGene
Dotmatics

实验模型和研究参与者详情：
所有动物实验均按照当地和国家的伦理指南进行，并获得了相应的伦理委员会批准（协议编号P015/2013、P026/2013和P214/2017，KU Leuven；以及ORBEA 332和99842/24-S，来自科英布拉大学，日期为2024年8月27日）。小鼠和大鼠在标准的饲养条件下饲养，可以持续获得食物和水。动物的健康和福利由指定的兽医监督。动物设施符合所有适当的标准（笼子类型、每只动物的空间、温度、光照、湿度、食物和水），并且所有笼子都配备了允许动物表达自然行为的材料。动物为了构建这些重组蛋白，首先通过PCR扩增目标基因的片段或gBlocks，然后将这些片段或gBlocks插入用适当的限制性内切酶消化的最终载体中。对于FUGW-FLAG-(ms)ICAM5、FUGW-FLAG-(hu)ICAM5、FUGW-HA-(hu)NLGN3、FUGW-HA-(hu)NLGN4X和FUGW-HA-(hu)NLGN4Y，将包含全长野生型(WT)序列的PCR片段或gBlocks插入经AgeI和EcoRI消化的pFUGW载体中。HA或FLAG表位标签被直接连接到信号肽之后。对于PLP-FLAG-(ms-ecto)ICAM5-Fc、PLP-FLAG-(hu-ecto)NLGN3-Fc、PLP-FLAG-(rat-ecto)NLGN1-Fc、PLP-FLAG-(rat-ecto)NLGN2-Fc和PLP-FLAG-(hu-ecto)NLGN4X-Fc，将包含WT细胞外域的PCR片段或gBlocks插入经NotI和SaII消化的PLP载体中。最后，对于pDisplay-(ms-ecto)ICAM5、pDisplay-(hu-ecto)ICAM5、pDisplay-(hu-ecto)ICAM1、pDisplay-(hu-ecto)ICAM2、pDisplay-(hu-ecto)ICAM3、pDisplay-(ms-ecto-Ig1)ICAM5、pDisplay-(ms-ecto-Ig2)ICAM5、pDisplay-(ms-ecto-Ig3)ICAM5、pDisplay-(ms-ecto-Ig1–3)ICAM5、pDisplay-(ms-ecto-Ig2–3)ICAM5和pDisplay-(ms-ecto-Ig4–9)ICAM5，将包含全长或部分细胞外域的PCR片段插入经BglII和SacII消化的pDisplay载体中，并确保它们与信号肽和HA表位标签在同一直线上，以便表达的蛋白质的细胞外域能够锚定在细胞膜上。本研究中使用的所有DNA构建物都经过了序列验证。完整的质粒列表见关键资源表。

重组蛋白的表达和纯化用于细胞表面结合检测和ECD-Fc亲和纯化：
NLGN3ECD-Fc和ICAM5ECD-Fc蛋白是通过使用PEI（Polysciences，商品编号24765）对其HEK293T细胞进行瞬时转染产生的。转染6小时后，将培养基更换为Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，商品编号22600134），并在5天后收集-conditioned media。conditioned media经过离心、无菌过滤后，加入到Repligen公司的CaptivA HF Protein A亲和树脂（商品编号CA-HF）快速流式柱中。用洗涤缓冲液（50 mM HEPES (pH 7.4), 300 mM NaCl）洗涤后，用IgG洗脱缓冲液（Thermo Fisher Scientific，商品编号21004）洗脱结合的蛋白质。含有蛋白质的馏分被合并并通过Slide-A-Lyzer（Thermo Fisher Scientific，商品编号66807）透析到PBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4; pH 7.4）中，然后使用Amicon Ultra离心装置（Millipore，商品编号UFC90500）浓缩。通过SDS-PAGE并使用Coomassie染色来评估纯化后的ecto-Fc蛋白的完整性和纯度，并通过Bradford assay（Bio-Rad，商品编号5000202）测定蛋白质浓度。

从突触小体提取物中捕获Fc-ectodomain结合伙伴的亲和纯化：
细胞外结合伙伴的亲和纯化方法基本与之前的Ecto-Fc互作组筛选方法相同。简要来说，将出生后第23天的大鼠全脑在添加了蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中用Dounce匀浆器进行匀浆。随后按照之前的方法从脑匀浆物中分离出突触小体。将分离出的突触小体加入Triton X-100（最终浓度1%）并在4°C下轻轻搅拌至少2小时以溶解膜蛋白。通过100,000 × g的超速离心在4°C下去除不溶性物质，然后使用澄清后的洗涤液进行亲和纯化。每次纯化时，将12–13 mL的澄清提取液在4°C下与50–100 μg固定在Protein A亲和树脂上的Fc融合ectodomain诱饵蛋白一起孵育过夜。同时进行单独使用Fc的平行纯化作为阴性对照。孵育后，将珠子悬浮液转移到色谱柱上，并用高盐洗涤缓冲液彻底清洗以去除非特异性结合物，最后用低盐洗涤液清洗。结合的蛋白质用酸性洗脱缓冲液洗脱并收集在微量离心管中。洗脱后的蛋白质通过加入最终浓度为20%的三氯乙酸（TCA）在冰上孵育过夜后沉淀。蛋白质沉淀物通过离心回收，用冰冷的丙酮洗涤两次，空气干燥后进行胰蛋白酶消化和质谱分析。

质谱（MS）：
NLGN3ECD-Fc和ICAM5ECD-Fc亲和纯化产物的质谱分析按照之前的方法进行。对于Orbitrap Fusion Tribrid MS分析，使用Pierce C18 spin柱（Thermo Fisher Scientific）通过自动进样器将2至3微克的肽装载到Acclaim PepMap 100 trap柱（75 μm × 2 cm，nanoViper）上，然后在nanoViper分析柱（Thermo Fisher Scientific，3 μm，100 ?，C18，75 μm × 500 mm）上进行分离，该柱配备了Nanospray Flex Ion Source和不锈钢发射器，喷液电压为2.0 kV。Buffer A由94.875% (vol/vol) H2O、5% (vol/vol) 乙腈和0.125% (vol/vol) 甲酸组成；Buffer B由99.875% (vol/vol) 乙腈和0.125% (vol/vol) 甲酸组成。色谱分离总共持续4小时，梯度如下：0–7% B在7分钟内，7–10%在6分钟内，10–25%在160分钟内，25–33%在40分钟内，33–50%在7分钟内，50–95%在5分钟内，最后保持在95% 15分钟。其他MS参数如下：离子传输管温度300°C；启用Easy-IC内部质量校正；默认电荷状态2；循环时间3秒。在Orbitrap上进行的全罩质谱扫描分辨率为60,000，宽四极杆分离。扫描范围为300–1,500 m/z，最大注入时间为50 ms，AGC目标为2 × 10^5，一次微扫描，S透镜射频级别为60。源碎片化被禁用，数据以正质心模式收集。对于电荷+2至+6的离子，启用单同位素前体选择（未指定的电荷状态被拒绝）。动态排除设置为30秒（5秒排除时间）在±10 ppm范围内。前体选择使用前20个最强离子，分离窗宽为1.6 m/z，正常扫描范围，第一个质量为110 m/z，碰撞能量为30%。对于CID，MS/MS谱在离子阱中以“rapid”速率获取，分辨率相当于30k，最大注入时间为75 ms，AGC目标为1 × 10^4，Q设置为0.25。谱图原始文件使用RawXtractor或RawConverter（https://www.scripps.edu/yates/Software.html）转换为ms1和ms2格式。串联质谱数据使用ProLuCID（版本3.1）在Intel Xeon Linux集群上针对UniProt大鼠蛋白组（下载日期2013年4月1日）进行搜索。搜索空间包括质量容忍窗口内的所有完全和部分胰蛋白酶切割的肽，没有混合切割的限制。半胱氨酸的氨基甲酰甲基化（+57.02146 Da）被设置为静态修饰。使用DTASelect2和SEQUEST定义的参数XCorr和DeltaCN评估肽-谱图匹配（PSM）的有效性。搜索结果按电荷状态（+1, +2, +3, 和 >+3）和胰蛋白酶状态（完全、部分和非胰蛋白酶）分组，生成12个子组。对于每个子组，分别获得XCorr、DeltaCN和DeltaMass的分布，并通过判别分析进行分离。由于无法完全分离，肽匹配概率是通过非参数拟合得分分布来计算的。应用了0.95的最小肽置信阈值。假发现率（FDR）计算为所有接受的PSM中反向欺骗PSM的比例。蛋白质至少需要一个高质量的部分胰蛋白酶切割肽（FDR <0.001）。对于高分辨率数据，还要求DeltaMass ≤10 ppm。

重组蛋白的表达和纯化用于SPR：
构建体通过无缝In-Fusion组装克隆（Takara Bio）生成，并通过Sanger测序或全质粒测序（MWG Eurofins, Source Genomics）进行验证。
为了制备多克隆稳定表达的HEK293细胞系，cDNA被克隆到一个改良的pHR-CMV-TetO2慢病毒载体中。在后者中，引入了一个受人类延长因子1α核心（EF-1αCORE）调控的嘌呤霉素抗生素选择标记cDNA（生成pHR-Puro-CMV-TetO2），从而可以在不依赖于目标基因（GOI）表达的情况下通过抗生素选择细胞。cDNA在C末端分别与mVenus-Twinstrep-Avi-His6标签（用于所有ICAM5构建体）或Avi-His6标签（用于其他所有构建体）融合。

多克隆稳定表达细胞系是通过使用已建立的方案对HEK293T或HEK293T TetRLENTI细胞进行慢病毒转导生成的。慢病毒是通过将HEK293T Lenti-X包装细胞（Takara Bio）与1:1:1 w/w/w的DNA质粒混合物转导而产生的，该混合物包括pMD2.G（包膜质粒）、psPAX2（包装质粒）和编码GOI的pHR-Puro-CMV-TetO2转移质粒。72小时后，收集含有病毒的 supernatant 并通过0.45 μm PES过滤器过滤。加入Polybrene（Merck），最终浓度为10 μg/mL以提高转导效率，然后转导表达细胞。转导后的表达细胞首先用嘌呤霉素（10 μg/mL）选择，持续时间从感染后48小时开始，最长5-7天。在整个选择过程中交替使用选择性培养基和无抗生素培养基，并每天监测耐药细胞群体的死亡和扩增情况。对于大规模分泌蛋白的生产，将融合的多克隆稳定细胞系扩增到贴壁滚瓶格式（Greiner Bio-One）中。对于HEK293T TetRLENTI细胞，在所需时间点加入多西环素（Dox）（1 μg/mL）以诱导表达。蛋白质表达持续5天。

conditioned expression media在20°C下以4,000 g离心20分钟，然后通过0.22 μm瓶盖过滤器进行无菌过滤。过滤后的培养基浓缩并更换为100 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl（TBS）的缓冲液，在?KTA Flux 6切向流式过滤系统（Cytiva）中进行交换，并添加20 mM咪唑。为了防止蛋白质降解，加入蛋白酶抑制剂混合物片剂（cOmplete，不含EDTA，Roche商品编号11873580001）。

蛋白质通过固定在金属亲和色谱（IMAC）上进行纯化，将浓缩并交换过缓冲液的培养基加载到预平衡了TBS缓冲液的5 mL HisTrap HP镍柱（Cytiva）上。用含50 mM咪唑的TBS洗涤柱子，然后用含250 mM咪唑的TBS洗脱蛋白质。洗脱后的蛋白质立即用20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl（HBS）缓冲液脱盐。

在20°C下使用重组人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶（1:500蛋白酶:蛋白质 w/w 比率）过夜消化后，去除3C可切割的纯化标签。之后，将蛋白质混合物重新加入1 mL HisTrap HP镍柱（Cytiva）中以去除His标签的3C蛋白酶、切割的标签、未切割的蛋白质和污染物。含有纯化蛋白质的HisTrap HP流穿液浓缩后，通过Superdex 200 PG HiLoad 16/600 PG柱（Cytiva）进行尺寸排除色谱（SEC）进一步纯化，该柱已用HBS平衡。纯化的蛋白质浓缩后，在液氮中快速冷冻，并在?80°C下储存。蛋白质的质量（稳定性、聚集、降解）通过基于荧光的热变性（NanoTemper Tycho）进行监测。

表面等离子共振（SPR）：
对于HEK293细胞中的小规模瞬时表达，cDNA被克隆到pHLsec-Avitag3质粒中，从而产生带有C末端生物素连接酶（BirA）识别位点的蛋白质。对于小规模生产体内生物素标记的Avi标签蛋白，稳定表达ER驻留BirA（BirA-ER）的HEK293T细胞进行瞬时转染。在100 μM D-biotin存在下表达72小时后，收集conditioned media并对照10 mM Tris (pH 7.4), 150 mM氯化钠, 3 mM氯化钙和0.005% (vol/vol) Tween 20 (TBS-CT)进行透析。

SPR实验在Biacore T200机器（GE Healthcare）上进行，操作温度为25°C，数据收集频率为10 Hz，即时间分辨率为0.1秒。链霉亲和素（Sigma-Aldrich；在10 mM醋酸钠（pH 4.5）中制备）通过胺偶联化学方法化学耦合到CM5芯片（Cytiva）上，达到5000 RU的响应单位水平。然后将生物素标记的蛋白质（配体）捕获到所需的RU水平（根据各自的分子量和所需的结合响应）。每两个分析物结合循环后进行一次缓冲液注入，以实现双重参考。SPR运行缓冲液的组成为10 mM Tris pH 7.5, 150 mM氯化钠, 0.005% (vol/vol) Tween 20, 3 mM氯化钙和1 g/L牛血清白蛋白（BSA；生成TBS-CTB缓冲液）。每个分析物在上述缓冲液中制备成2倍稀释系列，然后以25 μL/min的流速通过芯片。每种分析物注射150秒，随后是240秒的解离阶段。对于MDGA1，在解离阶段后还包括一个35秒的再生步骤。再生溶液的组成为1 M氯化镁。由于这些实验涉及高蛋白消耗，因此数据来自一个n=1的实验。β-NRXN1(–SS4)LNS6（500 RU）、ICAM5ECD（2200 RU）、MDGA1ECD（2000 RU）和PTPRδ(+meA3–meB)Ig123-Fn1（860RU）被固定，而NLGN3ECD以2倍稀释系列（100 μM–12.2 nM，共14个浓度）进行注射。NLGN1ECD、NLGN2ECD、NLGN3ECD、NLGN4XECD和NLGN4YECD（1000 RU）也被固定，而ICAM5 ECD、MDGA1 ECD和β-NRXN1(–SS4)LNS6以2倍稀释系列（50 μM–12.2 nM，共13个浓度）进行注射。平衡结合数据（1:1或1:2 Langmuir结合模型）的拟合和分析是使用Scrubber程序（v2，BioLogic Software）完成的。

**细胞表面结合实验**
HEK293T细胞（每孔40,000–60,000个细胞）被接种在铺有Poly-D-lysine的8孔显微镜载玻片上（Thermo Fisher Scientific，产品编号177402 PK），培养基为含有10%（体积/体积）FBS（Thermo Fisher Scientific，产品编号10270106）和1%（体积/体积）青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，产品编号15140122）的DMEM（Thermo Fisher Scientific，产品编号11965092）。当细胞密度约为50%时，根据制造商的说明，使用FuGENE 6（Promega，产品编号E2691）或PEI（Polysciences，产品编号24765）将编码相应受体的质粒转染到细胞中。转染24小时后，活细胞在室温下与Fc或ecto-Fc融合蛋白（10 μg/mL）在含有20 mM HEPES（pH 7.4）的DMEM中孵育1小时，然后用DMEM/20 mM HEPES（pH 7.4）洗涤两次，并在含有4%（重量/体积）甲醛和4%（重量/体积）蔗糖的PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.8 mM KH2PO4，10 mM Na2HPO4；pH 7.4）中固定15分钟。洗涤三次PBS后，细胞在4°C下用含有0.25%（体积/体积）Triton X-100的PBS渗透5分钟，或者不进行渗透直接进行免疫染色。随后在PBS中加入10%（重量/体积）BSA封闭1小时，并在4°C下用稀释在3%（重量/体积）BSA中的相应一级抗体孵育过夜，之后加入荧光标记的二级抗体（Jackson ImmunoResearch或Invitrogen）孵育1小时。

**共培养实验**
共培养实验按照先前描述的方法进行。简而言之，HEK293T细胞在含有10%（体积/体积）FBS（Thermo Fisher Scientific，产品编号10270106）和1%（体积/体积）青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，产品编号15140122）的DMEM中培养，并根据制造商的说明使用FuGENE 6（Promega，产品编号E2691）进行转染。转染24小时后，将HEK293T细胞机械分离并与DIV 7–9 WT小鼠皮质神经元共培养16小时。

**神经元转染**
皮质神经元在体外培养的第3–7天或第10–14天进行转染。每个盖玻片使用总共0.5 μg的DNA质粒。首先将DNA质粒稀释在Tris-EDTA缓冲液中（10 mM Tris-HCl和2.5 mM EDTA；pH 7.3），然后逐滴加入CaCl2溶液（2.5 M CaCl2在10 mM HEPES中；pH 7.2），使最终CaCl2浓度达到250 mM。将此溶液加入等量的HEPES缓冲液中（274 mM NaCl，10 mM KCl，1.4 mM Na2HPO4，42 mM HEPES；pH 7.2），轻轻涡旋3秒。所得混合物（含有沉淀的DNA）逐滴加入到含有250 μL含kynurenic acid（2 mM）的培养基的12孔培养板中的盖玻片上，然后在37°C、5%（体积/体积）CO2/95%（体积/体积）空气中孵育2小时。2小时后，移除转染液，并向每个盖玻片中加入1 mL含有kynurenic acid（2 mM）的培养基（用HCl略微酸化，最终浓度约为5 mM）。然后将培养板放回37°C、5%（体积/体积）CO2/95%（体积/体积）空气中孵育20分钟。最后，将盖玻片重新放入含有培养基的原始培养皿中，在37°C、5%（体积/体积）CO2/95%（体积/体积）空气中培养4天以允许表达构建物。

**免疫细胞化学**
神经元在室温下用含有4%（重量/体积）甲醛和4%（重量/体积）蔗糖的PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.8 mM KH2PO4，10 mM Na2HPO4；pH 7.4）固定10–15分钟，然后在4°C下用含有0.25%（体积/体积）Triton X-100的PBS渗透5分钟。随后在室温下用含有10%（重量/体积）BSA的PBS封闭1小时，并在4°C下用稀释在3%（重量/体积）BSA中的一级抗体孵育过夜。洗涤三次PBS后，细胞在室温下用稀释在3%（重量/体积）BSA中的荧光标记的二级抗体孵育1小时。盖玻片使用ProLong Gold Antifade mounting medium（Thermo Fisher Scientific，产品编号P36930）安装。

**活细胞染色**
大鼠皮质神经元在室温下与兔抗-HA抗体（1:100；Cell Signaling Technology，产品编号3724）单独或与鼠抗-FLAG抗体（1:500；Sigma-Aldrich，产品编号F3165）结合孵育15分钟（这两种抗体均溶解在含有kynurenic acid的培养基中）。然后神经元在室温下用含有4%（重量/体积）甲醛和4%（重量/体积）蔗糖的PBS固定10分钟，用PBS洗涤几次，并在室温下用含有10%（重量/体积）BSA的PBS封闭1小时。随后在室温下用稀释在3%（重量/体积）BSA中的相应抗兔和抗鼠二级抗体孵育1小时。渗透后，神经元按照上述方法进行免疫细胞化学处理。

**神经元裂解液制备**
DIV 7皮质神经元用冰冷的PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.8 mM KH2PO4，10 mM Na2HPO4；pH 7.4）洗涤两次。最后一次洗涤后，吸取PBS，细胞在冰上使用裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，125 mM NaCl，5 mM EDTA，1%（体积/体积）Triton X-100，1%（重量/体积） sodium deoxycholate，蛋白酶抑制剂混合物[Roche，产品编号11697498001]和磷酸酶抑制剂混合物[Roche，产品编号4906845001]裂解。每个孔加入100 μL裂解缓冲液，用塑料细胞刮刀刮取细胞并转移到微离心管中。裂解液在4°C下孵育30分钟，然后在4°C下以15,000 rpm离心20分钟。收集上清液到新的管中，丢弃不溶的沉淀物。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，产品编号23227）测定蛋白质浓度。随后使用裂解液进行Western blotting。

**Western blotting**
蛋白质提取物在95°C下用含有62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2%（体积/体积）SDS、10%（体积/体积）甘油、5%（体积/体积）β-mercaptoethanol和0.01%（重量/体积）bromophenol blue的5× Laemmli样品缓冲液煮沸5分钟变性。样品在10%（重量/体积）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，产品编号4561034）中通过Tris–glycine SDS运行缓冲液（25 mM Tris碱，192 mM glycine，和0.1%体积/体积SDS；pH 8.3）分离。蛋白质转移使用Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Kit（Bio-Rad，产品编号1704270）根据制造商的说明进行。膜在室温下用含有0.05%（体积/体积） Tween 20的Tris缓冲盐水（300 mM NaCl，25 mM Tris-HCl（pH 7.5）中预封闭1小时。一级抗体在5%（重量/体积）低脂牛奶中稀释，然后在4°C下与膜孵育过夜。在室温下用TBS-T洗涤五次后，膜在室温下用辣根过氧化物酶标记的二级抗体孵育1小时。膜在TBS-T中洗涤四次，然后用低盐TBS-T（150 mM NaCl，25 mM Tris-HCl（pH 7.5），0.05%（体积/体积）Tween 20）洗涤一次，并用化学发光ECL底物（Thermo Fisher Scientific，产品编号34095，产品编号34579或32132）孵育最多5分钟。信号使用Amersham ImageQuant 800 Western blot成像系统（Cytiva）检测。膜使用Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer（Thermo Fisher Scientific，产品编号46430）根据制造商的说明进行剥离。

**图像分析和量化**
所有来自固定细胞的免疫细胞化学实验的图像均使用Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystems）或Zeiss LSM 710共聚焦显微镜（Carl Zeiss Microscopy）获取。同一独立实验中获得的全部图像应用相同的共聚焦采集设置。调整采集参数以避免像素饱和。Z堆叠图像在分析前转换为最大强度投影图，但树突长度量化除外，该情况下在阈值处理和骨架化后生成投影图。定量图像分析使用Fiji软件进行。
细胞表面结合通过测量与HEK293T细胞相关的Fc信号来量化。首先根据GFP或HA免疫染色识别HEK293T细胞，并从阈值处理后的图像中定义细胞面积。Fc信号也进行阈值处理，然后测量每个HEK293T细胞上重叠的Fc标记区域。结合程度表示为Fc标记区域与相应HEK293T细胞总面积的比率。

为了量化总树突长度，使用Fiji macros自动化常规图像分析步骤。仅包括定义为GFP阳性且同时标记有MAP2的树突。GFP图像进行阈值处理以生成树突分支的二值掩膜，并使用2D/3D Skeletonize功能处理以获得单像素宽度的骨架。骨架化图像转换为最大强度投影图，然后使用Analyze Skeleton（2D/3D）功能测量总树突长度。所有基因型的树突长度均以WT对照条件进行归一化。
磷酸化PAK和F-actin的荧光强度从阈值处理后的图像中量化。生长锥区域通过MAP2阳性神经元内的phalloidin染色（F-actin）定义。对于每个细胞，将这些区域内的磷酸化PAK（或F-actin）的积分荧光强度求和，并归一化到相应阈值处理后的F-actin阳性区域内。
PSD-95的荧光强度从阈值处理后的图像中量化。使用与MAP2共标记的GFP阳性神经元作为引导，选择代表性的树突区域。对于每个细胞，测量这些树突区域内磷酸化PAK（或F-actin）的积分荧光强度，并归一化到相应阈值处理后的F-actin阳性区域内。
Synapsin1的积累作为突触生成的代理指标，通过测量与表达NLGN的HEK293T细胞相关的Synapsin1信号来量化。根据NLGN阳性免疫染色识别HEK293T细胞，并从阈值处理后的图像中定义细胞面积。Synapsin1标记也进行阈值处理，然后测量每个HEK293T细胞上重叠的Synapsin1信号区域。Synapsin1积累表示为Synapsin1阳性区域与相应HEK293T细胞总面积的比率。
使用Fiji中的JACoP插件进行HA-NLGN3和FLAG-ICAM5的共定位分析，以获得Manders重叠系数。首先生成MAP2掩膜，清除未转染的神经元区域，对图像进行阈值处理，创建感兴趣区域（ROIs）。然后在相应图像的MAP2掩膜内生成phalloidin掩膜。将先前生成的MAP2和phalloidin ROIs叠加到HA-NLGN3和FLAG-ICAM5通道上，并清除相应ROI外的信号。包含仅限于MAP2或phalloidin阳性区域的HA-NLGN3和FLAG-ICAM5信号的图像使用JACoP配对分析以确定Manders重叠系数。

**NLGN3和ICAM5的共定位分析**
使用Fiji中的JACoP插件从阈值处理后的图像中量化NLGN3和ICAM5点的共定位。首先生成MAP2掩膜，清除未转染的神经元区域，对图像进行阈值处理，创建选区并保存感兴趣的区域（ROIs）。随后在MAP2掩膜内生成phalloidin掩膜。将之前生成的MAP2和phalloidin ROIs叠加到HA-NLGN3和FLAG-ICAM5通道上，并清除ROI外的信号。然后分析包含HA-NLGN3和FLAG-ICAM5信号的图像对，以确定Manders重叠系数。

**SYNAPSN1的积累**
使用与表达NLGN的HEK293T细胞相关的Synapsin1信号来量化SYNAPSN1的积累。基于NLGN阳性免疫染色识别HEK293T细胞，并从阈值处理后的图像中定义细胞面积。Synapsin1标记也进行阈值处理，然后测量每个HEK293T细胞上重叠的Synapsin1信号区域。Synapsin1积累表示为Synapsin1阳性区域与相应HEK293T细胞总面积的比率。NLGN3–ICAM5的点状结构若与PSD-95重叠，则被归类为PSD-95阳性；若与Gephyrin重叠，则被归类为Gephyrin阳性。那些既不与PSD-95也不与Gephyrin重叠的NLGN3–ICAM5点状结构，则被归类为突触外结构。NLGN3–ICAM5点状结构在PSD-95阳性、Gephyrin阳性及突触外结构群体中的相对分布，以每个细胞中分析到的NLGN3–ICAM5共定位点状结构总数的百分比来表示。

结果以箱线图（中位数、第25-75百分位区间以及最小值至最大值）或单个数据点（均值±标准误）的形式呈现。数据分布的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估，统计显著性则根据情况使用参数化的非配对t检验或非参数化的Mann-Whitney检验及Kruskal-Wallis检验（随后进行Dunn的多重比较检验）来进行评估。每个分析都包含了至少两个独立实验的数据。统计分析使用GraphPad Prism 10.1.2版本完成。

补充信息（2）
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文件S1：图S1–S8
电子表格（422.50 KB）
表S1：该电子表格列出了使用重组NLGN3ECD-Fc或ICAM5ECD-Fc作为诱饵进行亲和蛋白组学和质谱分析后鉴定出的蛋白质。
电子表格包括：
(1) NLGN3-Fc数据集中检测到的蛋白质；
(2) ICAM5-Fc数据集中检测到的蛋白质；
(3) 两个数据集中都检测到的蛋白质（交叉分析结果），对应于图1A中的蛋白质。
每个数据集中的蛋白质均提供了光谱计数结果。