《Diagnostics》：Serum TLR2, TLR4, TLR2/TLR4 Ratio, and ESM1 in Sepsis: A Single-Center Prospective Observational Study of Diagnostic and Prognostic Associations
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背景/目的：脓毒症（Sepsis）仍是发病率和死亡率的主要原因，亟需可靠的诊断和预后生物标志物。本研究探讨了内皮细胞特异性分子-1（endothelial cell-specific molecule-1, ESM1）、Toll样受体（toll-like re
背景/目的：脓毒症（Sepsis）仍是发病率和死亡率的主要原因，亟需可靠的诊断和预后生物标志物。本研究探讨了内皮细胞特异性分子-1（endothelial cell-specific molecule-1, ESM1）、Toll样受体（toll-like receptor, TLR）2、TLR4及TLR2/TLR4比值在脓毒症中的诊断与预后关联。方法：在这项单中心前瞻性观察性研究中，研究人员测定了60例脓毒症患者和23例门诊对照者的血清生物标志物水平，并分析其与脓毒症存在及院内死亡率的关联。两组人口学特征和合并症具有可比性。结果：两组间ESM1、TLR4或TLR2/TLR4比值均未见显著差异（p > 0.05）。脓毒症患者TLR2水平低于对照组（中位数[四分位距]：0.551 [1.508] 对 1.394 [8.606]；p = 0.056），但未达统计学显著性。受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析显示TLR2的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.636（p = 0.080），在临界值≤3.2129时灵敏度为91.7%，特异度为47.8%。院内死亡率发生率为36.7%。非存活者血清肌酐（creatinine）水平高于存活者（中位数：2.30 对 0.89 mg/dL；p = 0.039），而人口学特征、临床表现、其他实验室参数或生物标志物水平与死亡率均未见显著关联。结论：脓毒症中TLR2水平数值上较低，但差异无统计学显著性。其诊断价值需在临床相关的对照人群中针对非感染性全身炎症进行验证。本队列中ESM1、TLR4或TLR2/TLR4比值未检测到显著的诊断或预后关联。
**研究背景** 脓毒症（Sepsis）是全球范围内导致死亡的主要原因之一，源于宿主反应失调并可导致器官功能障碍。脓毒症患者发生以血压显著下降为特征的脓毒性休克（septic shock）时，组织灌注压降低并可继而引起缺氧。在美国，脓毒症被认为是院内死亡最常见的原因，因其巨大的经济负担而被视为重大公共卫生问题。因此，亟需可靠的生物标志物以辅助脓毒症的实验室诊断、早期发现和预后评估。脓毒症可由多种感染性病原体触发，目前诊断金标准为微生物学检测，包括血培养、细菌鉴定及通过生化或显微镜技术进行的病原体特征分析。近年来，基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）的方法和质谱（mass spectrometry）等替代技术也被越来越多地采用，以期缩短诊断周转时间。鉴于脓毒症患者死亡率常超过40%，除早期筛查和识别外，还发展了其他策略；早期预防器官损伤并管理脓毒性休克的不同阶段可改善患者结局。多种生物标志物可助于在显著器官功能障碍发生前诊断脓毒症，包括乳酸（lactate）水平、高炎症期标志物（如促炎细胞因子和趋化因子）、感染和炎症反应中合成的蛋白（如C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）和降钙素原（procalcitonin））、中性粒细胞和单核细胞活化指标、抗炎细胞因子以及单核细胞和淋巴细胞表达的细胞表面受体。内皮细胞特异性分子-1（ESM1）是一种蛋白聚糖结构分子，被视为人类内皮细胞损伤的潜在标志物。白细胞介素（interleukin, IL）-1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α等炎症介质可增强内皮细胞中ESM1的表达，这种信号相互作用又可诱导细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）等黏附分子的表达，从而促进白细胞迁移并推动炎症反应。在诊断价值方面，有报道称ESM1在识别脓毒症及评估其严重程度方面与降钙素原相当；而作为预后生物标志物，ESM1被认为在脓毒症患者中优于降钙素原。此外，ESM1已被证明可用于预测医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia, HAP）、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）和肾功能障碍等疾病结局。病原体进入机体后，固有免疫细胞通过病原体识别受体（pathogen recognition receptors, PRRs）识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）。Toll样受体（TLRs）最早由Janeway于20世纪80年代末描述，是识别细菌细胞壁（bacterial cell wall, BCW）成分并调节固有免疫和炎症反应的结构。TLRs为膜结合受体，还可诱导细胞因子的转录和表达，从而增强细胞免疫功能。近年来，越来越多的关注投向TLR表达水平、其信号通路及其预测患者结局的潜在作用。本研究旨在探讨ESM1、TLR2、TLR4及TLR2/TLR4比值在脓毒症患者中的诊断和预后意义。
**研究方法** 本研究为单中心前瞻性观察性研究，于Samsun University, Samsun Training and Research Hospital开展。研究对象为2024年9月至12月期间在重症监护病房（intensive care unit, ICU）诊断为脓毒症的18岁及以上患者，脓毒症依据Sepsis-3标准诊断，即疑似或确诊感染伴急性器官功能障碍，表现为序贯器官衰竭评估（Sequential Organ Failure Assessment, SOFA）评分较基线增加至少2分。对照组为从感染性疾病门诊招募的23名符合研究纳入标准的门诊志愿者，通过临床检查排除急性感染。排除标准包括急性肾损伤（acute kidney injury, AKI，依据KDIGO标准定义）、急性卒中、急性冠脉综合征、肝硬化或慢性炎症性疾病（如胶原血管病、银屑病或炎症性肠病）以及诊断为COVID-19的患者。研究人员在ICU首次入院时记录人口学特征、生命体征、合并症和实验室值；TLR2、TLR4和ESM1检测血样在抗生素治疗开始前采集。主要死亡终点定义为院内全因死亡率。微生物学评估仅纳入血培养分离株，60例脓毒症患者血培养均为阳性，排除多微生物血流感染病例；凝固酶阴性葡萄球菌（包括表皮葡萄球菌）和微球菌属仅在至少两套独立血培养中分离出且有相容临床感染证据时才视为真正病原体，否则归类为污染菌并排除。血清ESM1（又称endocan）、TLR2和TLR4水平采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒测定，ESM1试剂盒检测限为9.38 pg/mL，测量范围15.63–1000 pg/mL；TLR2检测限为0.094 ng/mL，测量范围0.156–10 ng/mL；TLR4检测限为0.188 ng/mL，测量范围0.313–20 ng/mL。TLR4浓度低于检测限者不视为可可靠定量，因此低于该限值的观测值在涉及TLR2/TLR4比值的分析中排除，但在其他适用分析中保留。TLR2/TLR4比值通过各参与者血清TLR2浓度除以血清TLR4浓度计算。主要终点为这些生物标志物与脓毒症存在的关联，次要终点为生物标志物水平与脓毒症患者院内死亡率的关联。统计分析使用IBM SPSS Statistics 25.0版和MedCalc 20.0版，连续变量以中位数和四分位距（第25–75百分位数）或范围汇总，非正态分布的生物标志物组间比较采用Mann–Whitney U检验，分类变量采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验。为量化生物标志物组间差异，计算秩双列相关系数和Hodges–Lehmann位置偏移估计值，其95%置信区间（confidence intervals, CIs）采用分层非参数百分位自助法（5000次重抽样）估计。此外计算Holm校正p值以校正多重比较。采用ROC曲线分析评估生物标志物的诊断性能，判别能力以AUC及DeLong法计算的95% CIs表示，最佳临界值采用Youden指数确定，相应灵敏度和特异度及其95% CIs采用Clopper–Pearson精确法计算。进行探索性逻辑回归分析以研究生物标志物水平与院内死亡率之间的关联，鉴于死亡事件数量有限，每个模型仅纳入年龄和一个生物标志物以降低过拟合风险。还使用实际样本量进行了样本量敏感性分析，以估计在80%和90%统计功效下的最小可检测标准化效应量。
**研究结果**
*患者与对照组特征* 研究共纳入60例患者（72.3%）和23例对照者（27.7%）。患者组中位年龄为71岁（范围29–93岁），对照组为67岁（范围33–88岁），患者组中男性36例，对照组中男性13例。两组人口学特征和合并症具有可比性（所有p > 0.05）。脓毒症患者白细胞计数显著高于对照组（9150 [2100–29,000] 对 5900 [3700–10,200]；p = 0.002），CRP、总胆红素、直接胆红素和肌酐水平亦显著高于对照组（均p < 0.001）。
*血清生物标志物比较* 脓毒症患者与对照组间TLR2（p = 0.056）、TLR4（p = 0.102）、TLR2/TLR4比值（p = 0.791）或ESM1（p = 0.618）均未见统计学显著差异，相应秩双列相关系数分别为?0.272（95% CI：?0.555至0.038）、?0.232（95% CI：?0.496至0.044）、?0.038（95% CI：?0.317至0.245）和0.071（95% CI：?0.209至0.348）。基于实际样本量的敏感性分析显示，在双侧α为0.05、参数独立组比较假设下，80%和90%统计功效下的最小可检测标准化效应量（Cohen's d）分别为0.695和0.805。尽管脓毒症患者TLR2水平低于对照组（中位数[四分位距]：0.551 [1.508] 对 1.394 [8.606]），但差异仅呈临界趋势（p = 0.056）。
*TLR2的诊断性能* ROC曲线分析表明TLR2在区分脓毒症患者与健康对照方面具有中等判别性能（AUC = 0.636，95% CI：0.484–0.789；p = 0.080）。采用Youden指数确定的最佳临界值为≤3.2129，灵敏度为91.67%（95% CI：81.61–97.24%），特异度为47.83%（95% CI：26.82–69.41%）。
*病原体与感染来源* 在培养阳性的脓毒症患者中，最常分离的微生物为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii），各占23.3%。最常见的感染部位为腹膜炎（23.3%，n = 14）和尿源性脓毒症（urosepsis，21.7%，n = 13）。
*治疗与住院情况* 66.7%的患者（n = 40）接受了血管活性药物支持，记录药物包括多巴胺16例（26.7%）、去甲肾上腺素14例（23.3%）和肾上腺素10例（16.7%）。24例（40.0%）接受抗生素单药治疗，最常用药物为美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶/阿维巴坦，各5例（8.3%）；36例（60.0%）接受联合抗生素治疗，最常见为哌拉西林/他唑巴坦联合莫西沙星（11.7%）。患者平均住院时间为30.55 ± 19.96天。
*死亡率相关因素* 36.7%（n = 22）的患者发生死亡，中位住院时间为26.5天（范围5–102天）。非存活者血清肌酐水平显著高于存活者（中位数：2.30 对 0.89 mg/dL；p = 0.039）。人口学特征、临床表现、其他实验室参数或生物标志物水平与死亡率之间未发现显著关联。探索性年龄校正逻辑回归分析未发现所研究生生物标志物与院内死亡率之间的统计学显著关联，TLR2的优势比为0.961（95% CI：0.758–1.219；p = 0.745），TLR4为0.973（95% CI：0.877–1.079；p = 0.602），ESM1为1.000（95% CI：0.994–1.005；p = 0.930）。
*动脉血气参数* 患者组入院时和随访期间的动脉血气参数比较显示，治疗最初24小时内pH、pCO
2和乳酸水平显著改善（p < 0.05）。
**讨论部分总结** 讨论指出脓毒症并非同质群体，可分为不同的亚表型和内表型，其差异受临床参数、生命体征、微生物因素和感染部位以及生物标志物等多因素影响。与Abe等在日本的研究相比，本队列年龄和性别分布相当，但最常见感染部位不同（本组腹膜炎23.3%、尿源性脓毒症21.7%），且约25%患者为坏死性筋膜炎或Fournier坏疽继发脓毒症，提示皮肤软组织来源的特殊相关性。在病原体方面，本组最常见为肺炎克雷伯菌（23.3%）、鲍曼不动杆菌（23.3%）、金黄色葡萄球菌（13.3%）、大肠埃希菌（11.7%）和铜绿假单胞菌（10.0%），白色念珠菌仅2例（3.3%）；与文献相比，鲍曼不动杆菌高流行是显著偏差，且除白色念珠菌外无其他真菌，表明文献中日益强调的耳念珠菌感染在本研究人群中有限。关于ESM1，既往研究报道202 ng/mL的血清ESM1对COVID-19的灵敏度为86.7%、特异度为50%；Lassalle等报道ICU脓毒症患者ESM1 >3 ng/mL者72小时内发生肺损伤风险高，ESM1预测呼吸衰竭的灵敏度85%、特异度100%。而本研究中ESM1在患者与对照组间及死亡与存活者间均无显著差异，与既往报道相矛盾，提示该生物标志物的临床效用需在更大、更异质的人群中验证；差异可能归因于研究人群特征、疾病严重程度、合并症、纳入/排除标准不同，样本量有限导致统计功效降低，研究设计、采血时机、样本处理和实验室检测方法差异，以及抗生素、血管升压药和支持治疗策略差异和地理与时间因素导致的患者人群、医疗实践和病原体谱差异。关于TLR，近期证据提示脓毒症患者循环TLR2和TLR4水平可能改变，反映病程中固有免疫应答变化；本研究中TLR4水平和TLR2/TLR4比值在患者与对照组间无统计学显著差异，TLR2水平虽较低但仅呈临界趋势（p = 0.056），可能提示脓毒症中TLR2介导的免疫应答改变，反映高炎症与免疫抑制过程之间的平衡变化，但鉴于未达常规统计学显著且缺乏纵向测量，该解释仍属推测性，需更大型前瞻性研究证实。TLR2主要识别革兰阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，也可检测某些真菌和病毒成分；TLR4则识别革兰阴性菌脂多糖并在感染中引发强烈促炎反应。TLR2/TLR4比值缺乏预后价值提示这两种受体在脓毒症中可能独立调节。ROC分析显示TLR2判别性能中等（AUC = 0.636），临界值≤3.2129时灵敏度91.67%、特异度47.83%，特异度相对较低提示TLR2作为独立生物标志物的诊断效用有限，不应单独用于诊断脓毒症。研究局限性包括：样本量小、院内死亡例数有限（n = 22），限制了按疾病阶段、死亡状态和免疫抑制表型进行亚组分析并可能降低检测预后关联的统计功效；未进行正式的先验样本量计算；缺乏系统记录的SOFA和APACHE II评分、脓毒性休克状态及详细ICU管理数据（包括肾脏替代治疗、机械通气时长和ICU住院时间），限制了对疾病严重程度的全面评估；微生物学确认、培养采集相对于抗生素给药时机、抗微生物治疗时机与适宜性及感染源控制干预等信息不完整，妨碍了对潜在重要临床混杂因素的充分校正；单中心设计、潜在选择偏倚和缺乏外部验证限制了结果的普适性；ELISA测量变异性和缺乏连续生物标志物测量可能影响对生物标志物动力学的评估；使用门诊对照而非非感染性全身炎症的危重患者，妨碍了评估TLR2区分脓毒症与其他炎症状况的能力，可能引入谱偏倚并限制临床适用性；鲍曼不动杆菌感染及腹腔和皮肤/软组织感染来源占优势可能反映当地流行病学和转诊模式；缺乏系统收集的抗微生物药敏数据和多药耐药菌分类，妨碍了全面评估抗微生物耐药对临床结局的影响。未来研究应考虑无感染的危重患者（如大手术后或创伤后入院者）作为更临床相关的对照组，并开展多中心研究比较脓毒症与非感染性全身炎症、评估TLR2在现有诊断工具之外的增量诊断价值。
**研究结论翻译** 在这一ICU脓毒症患者前瞻性队列中，血清TLR2水平较门诊对照呈非显著性降低趋势（p = 0.056）。鉴于样本量小、对照组选择、临床异质性及缺乏外部验证，该发现应视为探索性并需进一步研究。相比之下，本队列中ESM1、TLR4或TLR2/TLR4比值未检测到统计学显著的诊断或预后关联。在评估的变量中，非存活者血清肌酐水平显著高于存活者，而所研究的生物标志物与死亡率之间未检测到显著关联；死亡率与人口学特征、临床表现或其他实验室参数之间亦未发现显著关联。有必要开展多中心研究，比较脓毒症与非感染性全身炎症，并评估TLR2在既有诊断工具之外的增量诊断价值。
